WikiDer > Флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия

Флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия (FLIC) это микроскопический метод, разработанный для достижения z-разрешения в нанометровом масштабе.

FLIC возникает всякий раз, когда флуоресцентный объекты находятся вблизи отражающей поверхности (например, кремниевой пластины). Возникающая интерференция между прямым и отраженным светом приводит к двойному греху.² модуляция интенсивности I флуоресцентного объекта в зависимости от расстояния h над отражающей поверхностью. Это позволяет нанометровые измерения высоты.

Микроскоп FLIC хорошо подходит для измерения топографии мембраны, содержащей флуоресцентные зонды, например искусственный липидный бислой, или живая клеточная мембрана или структура флуоресцентно меченых белки на поверхности.

Оптическая теория FLIC

Общая двухслойная система

Оптическая теория, лежащая в основе FLIC, была разработана Армином Ламбахером и Питером Фромхерцем. Они установили связь между наблюдаемой флуоресценцией интенсивность и расстояние от флуорофора до отражающего кремний поверхность.

Наблюдаемая интенсивность флуоресценции, ${ displaystyle I_ {FLIC}}$, - произведение вероятности возбуждения в единицу времени, ${ displaystyle P_ {ex}}$, и вероятность измерения излучаемого фотона в единицу времени, ${ displaystyle P_ {em}}$. Обе вероятности являются функцией высоты флуорофора над поверхностью кремния, поэтому наблюдаемая интенсивность также будет функцией высоты флуорофора. Самый простой вариант - это флуорофор, встроенный в диоксид кремния (показатель преломления ${ displaystyle n_ {1}}$) расстояние d от границы раздела с кремнием (показатель преломления ${ displaystyle n_ {0}}$). Флуорофор возбуждается светом с длиной волны ${ displaystyle lambda _ {ex}}$ и излучает свет с длиной волны ${ displaystyle lambda _ {em}}$. Единичный вектор ${ displaystyle '' e_ {ex} ''}$ дает ориентацию перехода диполь возбуждения флуорофора. ${ displaystyle P_ {ex}}$ пропорциональна квадрату проекции локального электрическое поле, ${ displaystyle F_ {in}}$, который включает эффекты вмешательство, от направления диполя перехода.
${ displaystyle P_ {ex} propto mid F_ {in} cdot e_ {ex} mid ^ {2}}$
Местное электрическое поле, ${ displaystyle F_ {in}}$на флуорофор влияет интерференция между прямым падающим светом и светом, отражающимся от поверхности кремния. Интерференция определяется разностью фаз. ${ displaystyle Phi _ {in}}$ дано
${ displaystyle Phi _ {in} = { frac {4 pi n_ {1} d cos theta _ {1} ^ {in}} { lambda _ {ex}}}}$
${ displaystyle theta _ {1} ^ {in}}$ - угол падающего света относительно нормали к плоскости кремния. Помехи не только модулируют ${ displaystyle F_ {in}}$, но поверхность кремния не полностью отражает падающий свет. Коэффициенты Френеля дают изменение амплитуды между падающей и отраженной волнами. В Коэффициенты Френеля зависят от углов падения, ${ displaystyle theta _ {я}}$ и ${ displaystyle theta _ {j}}$, то показатели преломления двух сред и поляризация направление. Углы ${ displaystyle theta _ {я}}$ и ${ displaystyle theta _ {j}}$ может быть связано Закон Снеллиуса. Выражения для коэффициентов отражения следующие:
${ displaystyle r_ {ij} ^ {TE} = { frac {n_ {i} cos theta _ {i} -n_ {j} cos theta _ {j}} {n_ {i} cos theta _ {i} + n_ {j} cos theta _ {j}}} quad r_ {ij} ^ {TM} = { frac {n_ {j} cos theta _ {i} -n_ { i} cos theta _ {j}} {n_ {j} cos theta _ {i} + n_ {i} cos theta _ {j}}}}$
TE относится к компоненту электрического поля, перпендикулярному плоскости падения, а TM к параллельному компоненту (плоскость падения определяется нормалью к плоскости и направлением распространения света). В декартов координаты, локальное электрическое поле равно
${ displaystyle F_ {in} = sin gamma _ {in} left [{ begin {array} {c} 0 1 + r_ {10} ^ {TE} { textit {e}} ^ { i Phi _ {in}} 0 end {array}} right] + cos gamma _ {in} left [{ begin {array} {c} cos theta _ {1} ^ {in} (1-r_ {10} ^ {TM} { textit {e}} ^ {i Phi _ {in}}) 0 sin theta _ {1} ^ {in} ( 1 + r_ {10} ^ {TM} { textit {e}} ^ {i Phi _ {in}}) end {array}} right]}$
${ displaystyle gamma _ {in}}$ - угол поляризации падающего света по отношению к плоскости падения. Ориентация диполя возбуждения зависит от его угла ${ displaystyle theta _ {ex}}$ к нормальному и ${ displaystyle phi _ {ex}}$ азимутально к плоскости падения.
${ displaystyle { textit {e}} _ {ex} = left [{ begin {array} {c} cos phi _ {ex} sin theta _ {ex} sin phi _ {ex} sin theta _ {ex} cos theta _ {ex} end {array}} right]}$
Приведенные выше два уравнения для ${ displaystyle F_ {in}}$ и ${ displaystyle { textit {e}} _ {ex}}$ можно комбинировать, чтобы получить вероятность возбуждения флуорофора в единицу времени ${ displaystyle P_ {ex}}$.
Многие из использованных выше параметров в обычном эксперименте могут отличаться. В это теоретическое описание следует включить изменение пяти следующих параметров.

• В согласованность возбуждающего света
• Угол падения (${ displaystyle theta _ {1} ^ {in}}$) возбуждающего света
• Угол поляризации (${ displaystyle gamma _ {in}}$) возбуждающего света
• Угол перехода диполя (${ displaystyle theta _ {ex}}$) флуорофора
• Длина волны возбуждающего света (${ displaystyle lambda _ {ex}}$)

Квадратная проекция ${ displaystyle mid F_ {in} cdot e_ {ex} mid ^ {2}}$ необходимо усреднить по этим величинам, чтобы получить вероятность возбуждения ${ displaystyle P_ {ex}}$. Усреднение по первым 4 параметрам дает
${ displaystyle < mid F_ {in} cdot e_ {ex} mid ^ {2}> propto int sin theta _ {1} ^ {in} d theta _ {1} ^ {in} A_ {in} ( theta _ {1} ^ {in}) times int sin theta _ {ex} d theta _ {ex} O ( theta _ {ex}) U_ {ex} ( лямбда _ {in}, theta _ {1} ^ {in}. theta _ {ex})}$${ displaystyle U_ {ex} = sin ^ {2} theta _ {ex} mid 1 + r_ {10} ^ {TE} { textit {e}} ^ {i Phi _ {in}} mid ^ {2} + sin ^ {2} theta _ {ex} cos ^ {2} theta _ {1} ^ {in} mid 1-r_ {10} ^ {TM} { textit { e}} ^ {i Phi _ {in}} mid ^ {2} +2 cos ^ {2} theta _ {ex} sin ^ {2} theta _ {1} ^ {in} mid 1 + r_ {10} ^ {TM} { textit {e}} ^ {i Phi _ {in}} mid ^ {2}}$

Пример графика интенсивности FLIC, показывающий относительную интенсивность флуоресценции, измеренную в зависимости от расстояния флуорофора от отражающей поверхности. На реальном экспериментальном участке пики могут быть разной высоты.

Коэффициенты нормализации не включены. ${ Displaystyle О ( тета _ {экс})}$ представляет собой распределение угла ориентации диполей флуорофора. В азимутальный угол ${ displaystyle phi _ {ex}}$ и угол поляризации ${ displaystyle gamma _ {in}}$ интегрированы аналитически, поэтому они больше не фигурируют в приведенном выше уравнении. Чтобы окончательно получить вероятность возбуждения в единицу времени, приведенное выше уравнение интегрируется по разбросу длин волн возбуждения с учетом интенсивности ${ displaystyle I ( lambda _ {ex})}$ и коэффициент экстинкции флуорофора ${ displaystyle epsilon ( lambda _ {ex})}$.
${ displaystyle P_ {ex} propto int d lambda _ {ex} I ( lambda _ {ex}) epsilon ( lambda _ {ex}) < mid F_ {in} cdot e_ {ex} mid ^ {2}>}$
Шаги для расчета ${ displaystyle P_ {em}}$ эквивалентны приведенным выше при вычислении ${ displaystyle P_ {ex}}$ за исключением того, что метки параметров Эм заменены на бывший и в заменяется на из.
${ displaystyle P_ {em} propto int d lambda _ {em} Phi _ {det} ( lambda _ {em}) { textit {f}} ( lambda _ {em}) < mid F_ {in} cdot e_ {ex} mid ^ {2}>}$
Результирующая измеренная интенсивность флуоресценции пропорциональна произведению вероятности возбуждения и вероятности излучения.

${ displaystyle I_ {FLIC} propto P_ {ex} P_ {em}}$
Важно отметить, что эта теория определяет соотношение пропорциональности между измеренной интенсивностью флуоресценции. ${ displaystyle I_ {FLIC}}$ и расстояние от флуорофора над отражающей поверхностью. Тот факт, что это отношение не равно равенству, окажет значительное влияние на экспериментальную процедуру.

Экспериментальная установка

Кремниевая пластина обычно используется в качестве отражающей поверхности в эксперименте FLIC. An окись слой затем термически выращивается поверх кремниевой пластины, чтобы действовать как прокладка. Поверх оксида помещают флуоресцентно меченый образец, такой как липидная мембрана, белки, связанные с клеткой или мембраной. После создания системы отбора проб все, что требуется, - это эпифлуоресцентный микроскоп и CCD камера для количественных измерений интенсивности.

Это схема примерной экспериментальной установки FLIC с кремнием, тремя оксидными слоями и флуоресцентно меченным липидным бислоем (желтые звезды обозначают флуорофоры.

Толщина диоксида кремния очень важна для точных измерений FLIC. Как упоминалось ранее, теоретическая модель описывает относительный Интенсивность флуоресценции измеряется в зависимости от высоты флуорофора. Положение флуорофора нельзя просто определить по одной измеренной кривой FLIC. Основная процедура заключается в изготовлении оксидного слоя не менее двух известных толщин (слой может быть изготовлен из фотолитографический техники и толщину, измеренную эллипсометрия). Используемая толщина зависит от измеряемого образца. Для образца с высотой флуорофора в диапазоне 10 нм лучше всего подойдет толщина оксида около 50 нм, потому что кривая интенсивности FLIC здесь самая крутая и будет давать наибольший контраст между высотой флуорофора. Толщина оксида более нескольких сотен нанометров может быть проблематичной, потому что кривая начинает размываться из-за полихроматического света и диапазона углов падения. Отношение измеренных интенсивностей флуоресценции при различной толщине оксида сравнивается с прогнозируемым соотношением для расчета высоты флуорофора над оксидом (${ displaystyle d _ { textit {f}},}$).
${ Displaystyle { frac {I_ {теория} (d_ {1})} {I_ {теория} (d_ {0})}} = { frac {I_ {exp} (d_ {1} + d _ { textit {f}})} {I_ {exp} (d_ {0} + d _ { textit {f}})}}}$
Вышеупомянутое уравнение затем можно решить численно, чтобы найти ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$. Недостатки эксперимента, такие как несовершенное отражение, ненормальное падение света и полихроматический свет, имеют тенденцию размывать резкие кривые флуоресценции. Разброс угла падения можно регулировать с помощью числовая апертура (Н.А.). Однако, в зависимости от используемой числовой апертуры, эксперимент даст хорошее поперечное разрешающая способность (x-y) или хорошее разрешение по вертикали (z), но не то и другое одновременно. Высокое значение N.A. (~ 1.0) дает хорошее разрешение по горизонтали, которое лучше всего подходит для определения топографии на большом расстоянии. Низкое числовое значение (~ 0,001), с другой стороны, обеспечивает точное измерение z-высоты для определения высоты флуоресцентно меченой молекулы в системе.

Анализ

Пример экспериментальных данных, собранных для флуоресцентно меченного образца более 16 толщин оксида. Подгонка кривой к 16 точкам данных даст высоту флуорофоров над поверхностью оксида.

Базовый анализ включает примерка данные интенсивности с теоретической моделью, допускающей расстояние флуорофора над поверхностью оксида (${ displaystyle d _ { textit {f}}}$Кривые FLIC смещаются влево по мере увеличения расстояния флуорофора над оксидом. ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$ обычно является параметром, представляющим интерес, но часто включаются несколько других свободных параметров для оптимизации соответствия. Обычно включаются коэффициент амплитуды (а) и постоянный аддитивный член для фона (b). Коэффициент амплитуды масштабирует относительную интенсивность модели, а постоянный фон сдвигает кривую вверх или вниз для учета флуоресценции, исходящей из областей вне фокуса, таких как верхняя сторона ячейки. Иногда числовая апертура (N.A.) микроскопа может быть свободным параметром при подгонке. Другие параметры, входящие в оптическую теорию, такие как различные показатели преломления, толщины слоев и длины световых волн, считаются постоянными с некоторой погрешностью. Микросхема FLIC может быть изготовлена ​​с оксидными террасами 9 или 16 различной высоты, расположенными в блоках. После получения флуоресцентного изображения каждый блок из 9 или 16 террас дает отдельную кривую FLIC, которая определяет уникальный ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$. Среднее ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$ находится путем компиляции всех ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$ значения в гистограмму.
В статистическая ошибка в расчете ${ displaystyle d _ { textit {f}}}$ исходит из двух источников: ошибки в подгонке оптической теории к данным и неточности в толщине оксидного слоя. Систематическая ошибка исходит из трех источников: измерение толщины оксида (обычно эллипсометром), измерение интенсивности флуоресценции с помощью ПЗС-матрицы и неопределенность параметров, используемых в оптической теории. Систематическая ошибка оценивается в ${ displaystyle sim 1nm}$.

Рекомендации

• Аджо-Франклин, Кэролайн М .; Ёсина-Исии, Чиаки; Боксер, Стивен Г. (2005). «Исследование структуры поддерживаемых мембран и связанных олигонуклеотидов с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Langmuir. Американское химическое общество (ACS). 21 (11): 4976–4983. Дои:10.1021 / la0468388. ISSN 0743-7463.
• Braun, D .; Фромгерц, П. (1997-10-01). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия адгезии клеток на окисленном кремнии». Прикладная физика A: Материаловедение и обработка материалов. ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 65 (4–5): 341–348. Дои:10.1007 / s003390050589. ISSN 0947-8396.
• Браун, Дитер; Фромхерц, Питер (1998-12-07). «Флуоресцентная интерферометрия адгезии нейрональных клеток на микроструктурированном кремнии». Письма с физическими проверками. Американское физическое общество (APS). 81 (23): 5241–5244. Дои:10.1103 / Physrevlett.81.5241. ISSN 0031-9007.
• Крейн, Джонатан М .; Кисслинг, Фолькер; Тамм, Лукас К. (2005). «Измерение липидной асимметрии в плоских поддерживаемых бислоев с помощью флуоресцентной интерференционной контрастной микроскопии». Langmuir. Американское химическое общество (ACS). 21 (4): 1377–1388. Дои:10.1021 / la047654w. ISSN 0743-7463.
• Кайдзука, Ёсихиса; Гровс, Джей Т. (20 марта 2006 г.). «Гидродинамическое демпфирование тепловых колебаний мембраны вблизи поверхностей, полученных с помощью флуоресцентной интерференционной микроскопии». Письма с физическими проверками. Американское физическое общество (APS). 96 (11): 118101. Дои:10.1103 / Physrevlett.96.118101. ISSN 0031-9007.
• Кисслинг, Фолькер; Тамм, Лукас К. (2003). «Измерение расстояний в поддерживаемых бислоев с помощью флуоресцентной интерференционно-контрастной микроскопии: полимерные подложки и белки SNARE». Биофизический журнал. Elsevier BV. 84 (1): 408–418. Дои:10.1016 / с0006-3495 (03) 74861-9. ISSN 0006-3495.
• Ламбахер, Армин; Фромгерц, Питер (1996). «Флуоресцентная интерференционно-контрастная микроскопия на окисленном кремнии с использованием мономолекулярного слоя красителя». Прикладная физика, материаловедение и обработка материалов. ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 63 (3): 207–216. Дои:10.1007 / bf01567871. ISSN 0947-8396.
• Ламбахер, Армин; Фромгерц, Питер (2002-06-01). «Люминесценция молекул красителя на окисленном кремнии и флуоресцентная интерференционная контрастная микроскопия биомембран». Журнал Оптического общества Америки B. Оптическое общество. 19 (6): 1435-1453. Дои:10.1364 / josab.19.001435. ISSN 0740-3224.
• Партасарати, Рагувир; Гровс, Джей Т. (2004). "Оптические методы визуализации топографии мембраны". Биохимия и биофизика клетки. ООО "Спрингер Сайенс энд Бизнес Медиа". 41 (3): 391–414. Дои:10.1385 / cbb: 41: 3: 391. ISSN 1085-9195.