WikiDer > Теги MS2

MS2 tagging

Теги MS2 это техника, основанная на естественном взаимодействии Бактериофаг MS2 белок оболочки с стебель-петля структура из геном фага,[1] который используется для биохимической очистки РНК-белковые комплексы и сотрудничал с GFP для обнаружения РНК в живых клетках.[2] Совсем недавно этот метод был использован для мониторинга появления РНК в живых клетках, в месте транскрипции или просто путем наблюдения за изменениями количества РНК в цитоплазме.[3][4] Это показало, что транскрипция как прокариотических, так и эукариотических генов происходит прерывисто с всплески транскрипции разделены нерегулярными интервалами.

Процедура

Начните с одноцепочечной РНК и создайте образец структур стержень-петля, добавив копии РНК-связывающих последовательностей MS2 в некодирующую область.[5] Белок MS2 должен быть слит с GFP и связан с мРНК, комплексом, который содержит копии РНК-связывающей последовательности MS2.[5] Слитый белок MS2-GFP экспрессировали путем переноса его в клетку с плазмидой. [5] (Лаборатория Роберта Сингера). Сигнал кодируется внутри РНК, и наличие сигнала сигнал ядерной локализации (NLS) внутри GFP-MS2 находятся два сигнала, которые вводятся из комплексов EGFP-MS2-РНК.[6]

Аффинная очистка РНК, меченой биотином MS2 (MS2-BioTRAP), является одним из методов in vivo идентификации взаимодействий белок-РНК.[7] Были экспрессированы как РНК, помеченная MS2, так и белковая метка MS2, а затем аффинное взаимодействие было использовано для облегчения процесса идентификации взаимодействий белок-РНК.[7]

Преимущества и недостатки

Преимущества:

Метод MS2-BioTRAP быстр, гибок и прост в настройке; он хорошо масштабируется и позволяет изучать физиологические условия взаимодействия белок-РНК.[7] Тег MS2 также эффективен для небольших молекул, когда белок оболочки MS2 используется для выделения различных рибонуклеопротеиновые частицы (РНП).[8]

Недостатки:

Одно из предостережений при маркировке MS2 заключается в том, что необходимо добавить множество копий стержневой петли MS2 внутри РНК, чтобы произвести достаточно сигнала для просмотра и отслеживания одной молекулы РНК в ядре.[5] При отслеживании более одной последовательности РНК в ядре культивируемых клеток требуется более одной целевой последовательности.[5] На это может повлиять белок MS2, который имеет классический основной сигнал ядерной локализации (NLS), поэтому он может повлиять на расположение комплекса РНК, и ядро ​​будет иметь большую часть GFP-MS2 [5](Лаборатория Роберта Сингера).[6] Накопление GFP-MS2 в ядре приведет к появлению сильных сигналов ядерной флуоресценции, которые задержат или предотвратят анализ ядерной локализации РНК, поскольку это затруднит анализ сплайсинга, редактирования РНК, ядерного экспорта РНК и трансляции РНК.[6] Более того, из-за добавления метки вторичная структура РНК может вносить артефакт.[5]

Кроме того, на уровни экспрессии малой некодирующей РНК (мРНК) и регуляторные свойства будет влиять тег MS2.[8] Кроме того, используя MS2 в качестве аффинной метки для очистки белка в E. кишечная палочка бактерии, ученые экспрессировали MS2-MBP, белок оболочки MS2, несущий мутации, слитые с мальтозосвязывающие белки. Предотвращенные мутации олигомеризация.[8]

Рекомендации

  1. ^ Йоханссон HE, Liljas L, Uhlenbeck OC (1997). «Узнавание РНК белком оболочки фага MS2». Семинары по вирусологии. 8 (3): 176–185. Дои:10.1006 / smvy.1997.0120.
  2. ^ Бертран Э, Шартран П., Шефер М., Шеной С.М., Зингер Р.Х., Лонг Р.М. (октябрь 1998 г.). «Локализация частиц мРНК ASH1 в живых дрожжах». Молекулярная клетка. 2 (4): 437–45. Дои:10.1016 / с1097-2765 (00) 80143-4. PMID 9809065.
  3. ^ Голдинг И., Паулссон Дж., Завильски С.М., Кокс ЕС (декабрь 2005 г.). «Кинетика активности генов у отдельных бактерий в реальном времени». Клетка. 123 (6): 1025–36. Дои:10.1016 / j.cell.2005.09.031. PMID 16360033. S2CID 10319035.
  4. ^ Чабб Дж. Р., Трчек Т., Шеной С. М., Певец Р. Х. (май 2006 г.). «Транскрипционная пульсация гена развития». Текущая биология. 16 (10): 1018–25. Дои:10.1016 / j.cub.2006.03.092. ЧВК 4764056. PMID 16713960.
  5. ^ а б c d е ж грамм "Живой и цветной | The Scientist Magazine®". Ученый. Получено 2017-03-12.
  6. ^ а б c "Технологии". Люцерна, Инк.. Получено 2017-03-12.
  7. ^ а б c Марчезе Д., де Гроот Н.С., Лоренцо Готор Н., Ливи С.М., Тарталья Г.Г. (ноябрь 2016 г.). «Достижения в характеристике РНК-связывающих белков». Междисциплинарные обзоры Wiley: РНК. 7 (6): 793–810. Дои:10.1002 / wrna.1378. ЧВК 5113702. PMID 27503141.
  8. ^ а б c Саид Н., Ридер Р., Гурвиц Р., Декерт Дж., Урлауб Х., Фогель Дж. (Ноябрь 2009 г.). «Экспрессия in vivo и очистка регуляторов малой РНК, меченных аптамером». Исследования нуклеиновых кислот. 37 (20): e133. Дои:10.1093 / nar / gkp719. ЧВК 2777422. PMID 19726584.