WikiDer > Тест на нуклеиновую кислоту

Nucleic acid test
«НААТ» перенаправляется сюда. Не следует путать с Na`at, Наат (деревня), или же Наат (значения).
Ротавирус

А тест на нуклеиновую кислоту (NAT) - это метод, используемый для обнаружения конкретного нуклеиновая кислота последовательность и, следовательно, обычно для обнаружения и идентификации конкретного вида или подвида организма, часто вирус или же бактерии что действует как возбудитель в кровь, ткань, мочаи т. д. NAT отличаются от других тестов тем, что они обнаруживают генетический материал (РНК или же ДНК) скорее, чем антигены или же антитела. Обнаружение генетических материалов позволяет ранней диагностике заболевания, поскольку для обнаружения антигенов и / или антител требуется время, чтобы они начали появляться в кровотоке.[1] Поскольку количество определенного генетического материала обычно очень мало, многие NAT включают в себя этап, который усиливает генетический материал, то есть делает его множество копий. Такие NAT называются тесты амплификации нуклеиновых кислот (НААТ). Есть несколько способов усиления, в том числе полимеразной цепной реакции (ПЦР), анализ смещения цепи (SDA) или опосредованный транскрипцией анализ (ТМА).[2]

Практически все методы амплификации нуклеиновых кислот и технологии обнаружения используют специфичность Watson-Crick. базовая пара; однониточный зонд или грунтовка захват молекул ДНК или же РНК целевые молекулы дополнительные пряди. Таким образом, конструкция жил зондов очень важна для повышения чувствительность и специфичность обнаружения. Тем не менее мутанты которые составляют генетическую основу множества заболеваний человека, обычно немного отличаются от нормальных нуклеиновых кислот. Часто они различаются только в одной базе, например, вставки, удаления, и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В этом случае легко может произойти несовершенное связывание зонда с мишенью, что приведет к ложный положительный результат результаты, такие как ошибка напряжение то есть комменсальный для одного патогенного. Много исследований было посвящено достижению одноосновной специфичности.

Достижения

Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двунитная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.

В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот.[3] Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент полностью комплементарен целевой последовательности. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается и становится менее термодинамически выгодной. Стандартная разность свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами для замены опоры на пальце ноги с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100 + со средним 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.

После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, которые также используют реакцию обмена пальцами ног.[4] Это позволило оптически обнаружить правильную цель и цель SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.

В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности по однонуклеотидным вариантам (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции».[5] В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, при минимуме 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами на основе гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.

Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР, получивший название Blocker Displacement Amplification (BDA).[6] Это термостойкая ПЦР, которая избирательно амплифицирует все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно определять сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.

Приложения

  • Диагностика гонококковой инфекции и других инфекций Neisseria: амплификация конкретных последовательностей ДНК или РНК N. gonorrhea для обнаружения.[7]
  • Диагностика урогенитальной инфекции C. trachomatis[8]
  • Обнаружение Mycobacterium tuberculosis[9]
  • Обнаружение РНК или ДНК ВИЧ[10]
  • Обнаружение зоонозных коронавирусов[11]

Рекомендации

  1. ^ «Что такое тест на нуклеиновую кислоту (NAT)?». Американский Красный Крест.
  2. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, патогены и практика (третье издание). Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  3. ^ Пэн Инь, Дэвид Чжан (2012). «Оптимизация специфичности гибридизации нуклеиновых кислот». Химия природы. 4 (3): 208–214. Bibcode:2012НатЧ ... 4..208Z. Дои:10.1038 / NCHEM.1246. ЧВК 4238961. PMID 22354435.
  4. ^ Георг Силиг, Шерри Чен (2013). «Условно флуоресцентные молекулярные зонды для обнаружения изменений одного основания в двухцепочечной ДНК». Химия природы. 5 (9): 782–789. Bibcode:2013НатЧ ... 5..782С. Дои:10.1038 / NCHEM.1713. ЧВК 3844531. PMID 23965681.
  5. ^ Дэвид Чжан, Цзюэсяо Шерри Ван (2015). «Дизайн ДНК-зонда на основе моделирования для последовательной сверхспецифической гибридизации». Химия природы. 7 (7): 545–553. Bibcode:2015НатЧ ... 7..545Вт. Дои:10.1038 / NCHEM.2266. ЧВК 4479422. PMID 26100802.
  6. ^ Дэвид Чжан, Люсия Р. Ву (2017). «Мультиплексное обогащение редких вариантов ДНК посредством селективной по последовательности и устойчивой к температуре амплификации». Природа Биомедицинская инженерия. 1 (9): 714–723. Дои:10.1038 / s41551-017-0126-5. ЧВК 5969535. PMID 29805844.
  7. ^ Питер А. Леоне, Джозеф А. Дункан (2011). Тропические инфекционные болезни: принципы, патогены и практика (третье издание). Филадельфия: Эльзевьер. С. 184–190.
  8. ^ Вентилятор, Хуэйчжоу (2015). Молекулярная медицинская микробиология (второе издание). Академическая пресса. С. 1449–1469.
  9. ^ Риддерхоф, Джон C (2009). Туберкулез. Эльзевир. С. 738–745.
  10. ^ Гиллеспи, Сьюзен Л. (2013). Клиническая иммунология (четвертое издание). Эльзевир. С. 465–479.
  11. ^ Шмидт, Майкл; Брикснер, Вероника; Рустер, Бриджит; Hourfar, Майкл К .; Дростен, Кристиан; Прайзер, Вольфганг; Зейфрид, Эрхард; Рот, В. Курт (апрель 2004 г.). «NAT-скрининг доноров крови на коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома может потенциально предотвратить передачу, связанную с переливанием крови». Переливание. 44 (4): 470–475. Дои:10.1111 / j.1537-2995.2004.03269.x. ISSN 0041-1132. PMID 15043560.