WikiDer > PUC19

PUC19

Векторная карта pUC19

pUC19 одна из серии плазмид клонирование векторов сделано Иоахим Мессинг и коллеги.[1] Обозначение «pUC» происходит от классического префикса «p» (обозначающего «плазмида") и сокращение для Калифорнийский университет, где были проведены ранние работы над серией плазмид.[2] Это кольцевая двухцепочечная ДНК с 2686 парами оснований.[3] pUC19 - одна из наиболее широко используемых векторных молекул в качестве рекомбинантыили клетки, в которые была введена чужеродная ДНК, можно легко отличить от нерекомбинантов на основе различий в цвете колоний на питательной среде. pUC18 похож на pUC19, но область MCS обратная.

Составные части

Примечательно, что он имеет N-концевой фрагмент β-галактозидазы (lacZ) ген Кишечная палочка.[4] В сайт множественного клонирования (MCS) область расщеплена на кодоны 6-7 гена lacZ, обеспечивая многие эндонуклеазы рестрикции сайты ограничения.[5] Помимо β-галактозидазы, pUC19 также кодирует ампициллин ген устойчивости (ampр) через фермент β-лактамазу, который функционирует, разрушая ампициллин и снижая его токсичность для хозяина.[6]

В Ори сайт, или начало репликации, происходит от плазмиды pMB1. pUC19 небольшой, но имеет большое количество копий. Большое количество копий является результатом отсутствия прыгать ген и одноточечная мутация в ori pMB1.[7] В lacZ генные коды для β-галактозидаза. Сайты признания для HindIII, SphI, PstI, SalI, XbaI, BamHI, SmaI, КПНИ, SacI и EcoRI рестрикционные ферменты произошли от вектора M13mp19.[8]

Функция

Эта плазмида вводится в бактериальную клетку с помощью процесса, называемого "трансформация", где он может размножаться и самовыражаться. Однако из-за присутствия MCS и нескольких сайтов рестрикции в него может быть введен выбранный чужеродный фрагмент ДНК, вставив его на место в области MCS. плазмиду можно отличить от клеток, которые не поглотили плазмиду, выращивая ее на среде с ампициллином. Только клетки с плазмидой, содержащей резистентность к ампициллину (усилительр) ген выживет. Кроме того, трансформированные клетки, содержащие плазмиду с представляющим интерес геном, можно отличить от клеток с плазмидой, но без интересующего гена, просто взглянув на цвет колонии, которую они образуют на агаровой среде с добавлением IPTG и X-gal. Рекомбинанты имеют белый цвет, а нерекомбинанты - синий цвет.

Механизм

Схематическое изображение молекулярного механизма скрининга рекомбинантных клеток.

В lac Z Фрагмент, синтез которого может быть индуцирован IPTG, способен к внутриаллельной комплементации с дефектной формой фермента β-галактозидазы, кодируемой хромосомой хозяина (мутация lacZDM15 в штаммах E. coli JM109, DH5α и XL1-Blue).[9] В присутствии IPTG в питательной среде бактерии синтезируют оба фрагмента фермента. Оба фрагмента могут вместе гидролизовать X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) и образовывать синие колонии при выращивании на среде, где он добавлен.

Вставка чужеродной ДНК в MCS, расположенную внутри lac Z генные причины инсерционная инактивация этого гена в N-концевой фрагмент бета-галактозидаза и отменяет внутриаллельную комплементацию. Таким образом, бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды в MCS, не могут гидролизовать X-gal, вызывая образование белых колоний, которые можно отличить на культуральной среде от нерекомбинантных клеток, которые имеют синий цвет.[10]

Следовательно, используемый носитель должен содержать ампициллин, IPTG, и X-gal.

Использование в исследованиях

Благодаря широкому использованию в качестве вектора клонирования в исследованиях и промышленности, pUC19 часто используется в исследованиях в качестве модельной плазмиды.[11] Например, биофизические исследования его естественного суперскрученный государство определило свой радиус вращения быть 65,6 нм и его Радиус Стокса быть 43,6 нм.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Yanisch-Perron, C .; Vieira, J .; Мессинг, Дж. (1985). «Улучшенные векторы для клонирования фага M13 и штаммы-хозяева: нуклеотидные последовательности векторов M13mp18 и pUC19». Ген. 33 (1): 103–119. Дои:10.1016/0378-1119(85)90120-9. PMID 2985470.
  2. ^ Vieira, J .; Мессинг, Дж. (1982). «Плазмиды pUC, производная от M13mp7 система для инсерционного мутагенеза и секвенирования с синтетическими универсальными праймерами». Ген. 19 (3): 259–268. Дои:10.1016/0378-1119(82)90015-4. PMID 6295879.
  3. ^ Описание pUC19 и карта ограничений
  4. ^ Луро, Рикардо О .; Крайтон, Роберт Р. (2013). Практические подходы к биологической неорганической химии. Амстердам, Оксфорд: Эльзевир. п. 279. ISBN 9780444563590. Получено 7 апреля, 2014.
  5. ^ Луро, Рикардо О .; Крайтон, Роберт Р. (2013). Практические подходы к биологической неорганической химии. Амстердам, Оксфорд: Эльзевир. п. 279. ISBN 9780444563590. Получено 7 апреля, 2014.
  6. ^ Ван, Нам Сун. «Сводка сайтов на pUC19». Департамент химической и биомолекулярной инженерии Университета Мэриленда. Получено 27 января 2017.
  7. ^ Саха; и другие. (2004). «Возникающая в природе точечная мутация в 13-мерном повторе R влияет на функцию oriC большой хромосомы классического биотипа Vibrio cholerae O1». Архив микробиологии. 182 (5): 421–427. Дои:10.1007 / s00203-004-0708-y. PMID 15375645.
  8. ^ Мурленд; и другие. (2013). Продвинутая биомолекулярная генетика. Kleiske Publishing. С. 889–932.
  9. ^ Луро, Рикардо О .; Крайтон, Роберт Р. (2013). Практические подходы к биологической неорганической химии. Амстердам, Оксфорд: Эльзевир. п. 279. ISBN 9780444563590. Получено 7 апреля, 2014.
  10. ^ Пастернак, Джек Дж. (2005). Введение в молекулярную генетику человека, второе издание. Wiley-IEEE. п. 117. ISBN 978-0-471-71917-5.
  11. ^ Стёркле, Доминик (5 сентября 2007 г.). «Сложное образование ДНК с противоположно заряженными полиэлектролитами различной топологии цепи: цилиндрические щетки и дендримеры». Макромолекулы. 40 (22): 7998–8006. Bibcode:2007MaMol..40.7998S. Дои:10.1021 / ma0711689.

внешняя ссылка