WikiDer > Сборка для циклирования полимеразы

Сборка для циклирования полимеразы (или же PCA, также известный как Сборка ПЦР) - метод сборки больших ДНК олигонуклеотиды из более коротких фрагментов. В процессе используется та же технология, что и ПЦР, но использует преимущества гибридизации и отжига ДНК, а также ДНК-полимераза для амплификации полной последовательности ДНК в точном порядке на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, используемых в процессе. Таким образом, это позволяет производить синтетические гены и даже целиком синтетические геномы.

Принципы СПС

Подобно тому, как конструируются праймеры, так что есть прямой праймер и обратный праймер, способные позволить ДНК-полимеразе заполнять всю матричную последовательность, PCA использует ту же технологию, но с несколькими олигонуклеотидами. В то время как в ПЦР обычный размер используемых олигонуклеотидов составляет 18 пар оснований, в PCA длины до 50 используются для обеспечения уникальности и правильной гибридизации.

Каждый олигонуклеотид сконструирован как часть верхней или нижней цепи целевой последовательности. Эти олигонуклеотиды должны обладать обычными свойствами аналогичных температур плавления, не иметь шпилек и не слишком богатых на ГХ, чтобы избежать тех же осложнений, что и ПЦР, помимо основного требования, заключающегося в том, чтобы иметь возможность мозаить всю последовательность-мишень.

Во время циклов полимеразы олигонуклеотиды отжигаются с комплементарными фрагментами, а затем заполняются полимеразой. Таким образом, каждый цикл увеличивает длину различных фрагментов случайным образом в зависимости от того, какие олигонуклеотиды находят друг друга. Крайне важно, чтобы все фрагменты каким-либо образом были комплементарны, иначе не будет получена окончательная полная последовательность, поскольку полимераза требует наличия шаблона.

После этой начальной фазы конструирования добавляются дополнительные праймеры, охватывающие оба конца, для проведения регулярной реакции ПЦР, амплификации целевой последовательности от всех более коротких неполных фрагментов. Затем можно использовать гель-очистку для идентификации и выделения полной последовательности.

Типичная реакция

Типичная реакция состоит из олигонуклеотидов длиной ~ 50 пар оснований, каждая из которых перекрывается примерно на 20 пар оснований. Затем проводят реакцию со всеми олигонуклеотидами в течение ~ 30 циклов, за которыми следуют дополнительные 23 цикла с концевыми праймерами.^[1]

Сборка Гибсона

Модификация этого метода, Сборка Гибсона, описанный Гибсоном и др. позволяет производить одностадийную изотермическую сборку ДНК до нескольких сотен kb. Используя экзонуклеазу Т5 для «пережевывания» комплементарных концов, можно создать перекрытие примерно в 40 п.н. Реакция протекает при 50 ° C, температуре, при которой экзонуклеаза T5 нестабильна. После короткого временного интервала он разрушается, перекрытия можно отжечь и лигировать.^[2] Кембриджский университет IGEM команда сняла видео с описанием процесса.^[3] Клонирование, независимое от лигирования (LIC), представляет собой новый вариант метода объединения нескольких фрагментов ДНК, при котором для реакции требуется только фермент экзонуклеаза. Однако этот метод требует соединения четного числа фрагментов ДНК и (обычно с помощью ПЦР) синтеза подходящих адаптеров. Таким образом, LIC нельзя рассматривать как метод субклонирования «без рубцов».

Рекомендации

• Штеммер; и другие. (1995). «Одностадийная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Ген. 164 (1): 49–53. Дои:10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID 7590320.
• Смит; и другие. (2003). «Создание синтетического генома путем сборки всего генома: бактериофаг [var phi] X174 из синтетических олигонуклеотидов». PNAS. 100 (26): 15440–15445. Дои:10.1073 / pnas.2237126100. ЧВК 307586. PMID 14657399.