WikiDer > МТТ анализ

MTT assay
А микротитровальный планшет после анализа МТТ. Увеличение количества клеток привело к усилению пурпурной окраски.

В МТТ анализ это колориметрический анализ для оценки метаболической активности клеток.[1] НАД (Ф) Н-зависимые клеточные ферменты оксидоредуктазы могут в определенных условиях отражать количество присутствующих жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель МТТ 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилбромид тетразолия до нерастворимого формазан, имеющий фиолетовый цвет. Другие близкородственные тетразолиевые красители, включая XTT, MTS и WST, используются вместе с промежуточным акцептором электронов, метосульфатом 1-метоксифеназина (PMS). С WST-1, который является непроницаемым для клеток, восстановление происходит вне клетки посредством транспорта электронов через плазматическую мембрану.[2] Однако это традиционно предполагаемое объяснение в настоящее время оспаривается, поскольку также было найдено доказательство восстановления МТТ до формазана в липидных клеточных структурах без очевидного участия оксидоредуктаз.[3]

Анализы с красителем тетразолием также можно использовать для измерения цитотоксичности (потеря жизнеспособных клеток) или цитостатической активности (переход от пролиферации к состоянию покоя) потенциальных лекарственных агентов и токсичных материалов. Анализы МТТ обычно проводят в темноте, поскольку реагент МТТ чувствителен к свету.

МТТ и родственные соли тетразолия

Снижение МТТ

МТТ, желтый тетразол, сводится к фиолетовый формазан в живых клетках.[4] Раствор для солюбилизации (обычно либо диметилсульфоксид, подкисленный раствор этанола или раствор моющее средство додецилсульфат натрия в разбавленном соляная кислота) добавляется для растворения нерастворимого пурпурного формазан продукт в цветной раствор. В поглощение этого окрашенного раствора можно количественно измерить при определенном длина волны (обычно от 500 до 600 нм) на спектрофотометр. Степень поглощения света зависит от степени концентрации формазана, накопленной внутри клетки и на ее поверхности. Чем выше концентрация формазана, тем более глубокий пурпурный цвет и, следовательно, выше поглощение.

XTT (2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолий-5-карбоксанилид) был предложен для замены МТТ, обеспечивая более высокую чувствительность и более высокий динамический диапазон. Образовавшийся формазановый краситель растворим в воде, что позволяет избежать стадии окончательной солюбилизации.[5]

Водорастворимые соли тетразолия являются более поздней альтернативой МТТ: они были разработаны путем введения положительных или отрицательных зарядов и гидроксильные группы с фенильным кольцом тетразолиевой соли или лучше с сульфонат группы, добавленные прямо или косвенно к фенильному кольцу.

МТС (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолий) в присутствии метосульфата феназина (ПМС), производит формазановый продукт, который имеет максимум поглощения при 490 нм в фосфатно-солевом буфере. Анализ MTS часто описывается как «одностадийный» анализ МТТ, который предлагает удобство добавления реагента прямо в культуру клеток без периодических шагов, требуемых в анализе МТТ. Однако это удобство делает анализ MTS чувствительным к колориметрическому вмешательству, поскольку прерывистые этапы анализа MTT удаляют следы окрашенных соединений, в то время как они остаются в микротитровальном планшете в одноэтапном анализе MTS. Необходимы меры предосторожности для обеспечения точности при использовании этого анализа, и есть веские аргументы в пользу подтверждения результатов MTS с использованием качественных наблюдений под микроскопом. (Это, однако, разумно для всех цветометрических анализов.)[6]

WST (водорастворимые соли тетразолия) представляют собой серию других водорастворимых красителей для анализов МТТ, разработанных для получения различных спектров поглощения образующихся формазанов.[7] WST-1 и, в частности, WST-8 (2- (2-метокси-4-нитрофенил) -3- (4-нитрофенил) -5- (2,4-дисульфофенил) -2H-тетразолий) имеют преимущество перед МТТ в что они восстанавливаются вне клеток, в сочетании с электронным медиатором PMS и дают водорастворимый формазан. Наконец, анализы WST (1) могут быть прочитаны напрямую (в отличие от МТТ, который требует стадии солюбилизации), (2) дают более эффективный сигнал, чем МТТ, и (3) снижают токсичность для клеток (в отличие от проницаемого для клеток МТТ и его нерастворимого формазан, которые накапливаются внутри клеток).[7]

Значение теста МТТ

Обычно предполагается, что восстановление тетразолиевого красителя зависит от NAD (P) H-зависимых ферментов оксидоредуктазы в основном в цитозольном компартменте клетки.[2][8] Следовательно, уменьшение МТТ и других тетразолиевых красителей зависит от клеточной метаболической активности, обусловленной потоком НАД (Ф) Н. Клетки с низким метаболизмом, такие как тимоциты и спленоциты, очень мало снижают МТТ. Напротив, быстро делящиеся клетки демонстрируют высокие темпы снижения МТТ. Важно иметь в виду, что условия анализа могут изменять метаболическую активность и, таким образом, восстановление тетразолиевого красителя, не влияя на жизнеспособность клеток. Кроме того, механизм восстановления тетразолиевых красителей, т.е. внутриклеточный (МТТ, МТС) vs. внеклеточный (WST-1), также будет определять количество продукта. Кроме того, были представлены доказательства спонтанного снижения МТТ в липидных клеточных компартментах / структурах без участия ферментативного катализа.[3] Тем не менее, даже в рамках этой альтернативной парадигмы, анализ МТТ по-прежнему оценивает восстановительный потенциал клетки (то есть доступность восстанавливающих соединений для управления клеточной энергией).[1] Таким образом, окончательная интерпретация жизнеспособности клеток остается неизменной.

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ а б Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (апрель 2018 г.). «Соли тетразолия и продукты формазана в клеточной биологии: оценка жизнеспособности, флуоресцентная визуализация и перспективы маркировки» (PDF). Acta Histochemica. 120 (3): 159–167. Дои:10.1016 / j.acthis.2018.02.005. PMID 29496266.
  2. ^ а б Берридж М.В., Херст П.М., Тан А.С. (2005). «Тетразолиевые красители как инструменты в клеточной биологии: новый взгляд на их клеточное сокращение». Годовой обзор биотехнологии. 11: 127–52. Дои:10.1016 / S1387-2656 (05) 11004-7. ISBN 9780444519528. PMID 16216776.
  3. ^ а б Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A (декабрь 2012 г.). «МТТ-анализ жизнеспособности клеток: внутриклеточная локализация формазанового продукта находится в липидных каплях». Acta Histochemica. 114 (8): 785–96. Дои:10.1016 / j.acthis.2012.01.006. PMID 22341561.
  4. ^ Мосманн Т. (декабрь 1983 г.). «Быстрый колориметрический анализ клеточного роста и выживаемости: применение для анализов пролиферации и цитотоксичности». Журнал иммунологических методов. 65 (1–2): 55–63. Дои:10.1016/0022-1759(83)90303-4. PMID 6606682.
  5. ^ «Почему я должен использовать XTT вместо MTT» (PDF, 0,1 МБ). [aniara.com]. АНИАРА. Получено 2010-11-19.
  6. ^ Кори А.Х., Оуэн Т.С., Барлтроп Дж. А., Кори Дж. Г. (июль 1991 г.). «Использование водорастворимого анализа тетразолия / формазана для анализа роста клеток в культуре». Рак коммуникации. 3 (7): 207–12. Дои:10.3727/095535491820873191. PMID 1867954.
  7. ^ а б «Водорастворимые соли тетразолия (WST)» (PDF, 0,4 МБ). [interchim.com]. Интерхим. Получено 2013-08-12.
  8. ^ Берридж М.В., Тан А.С. (июнь 1993 г.). «Характеристика клеточного восстановления 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ): субклеточная локализация, зависимость от субстрата и участие митохондриального транспорта электронов в восстановлении МТТ». Архивы биохимии и биофизики. 303 (2): 474–82. Дои:10.1006 / abbi.1993.1311. PMID 8390225.

дальнейшее чтение

внешние ссылки