WikiDer > Мегануклеаза

Meganuclease

Мегануклеазы находятся эндодезоксирибонуклеазы характеризуются большим сайтом узнавания (двухцепочечные последовательности ДНК от 12 до 40 пар оснований); в результате этот сайт обычно появляется только один раз в геном. Например, для последовательности из 18 пар оснований, распознаваемой мегануклеазой I-SceI, в среднем потребуется геном, в двадцать раз превышающий размер человеческий геном быть обнаруженным один раз случайно (хотя последовательности с одним несоответствием встречаются примерно три раза на геном размером с человека). Поэтому мегануклеазы считаются наиболее специфическими встречающимися в природе рестрикционные ферменты.

Среди мегануклеаз семейство LAGLIDADG самонаводящиеся эндонуклеазы стал ценным инструментом для изучения геномов и геномная инженерия за последние пятнадцать лет. Мегануклеазы являются «молекулярными ДНК ножницы », которые можно использовать для точной замены, удаления или модификации последовательностей. Изменяя их последовательность распознавания Посредством белковой инженерии целевая последовательность может быть изменена. Мегануклеазы используются для модификации всех типов генома, будь то бактериальный, растительный или животный. Они открывают широкие возможности для инноваций, особенно в области здоровья человека, например, устранение вирусного генетического материала или «восстановление» поврежденных генов с помощью генной терапии.

Две основные семьи

Мегануклеазы обнаружены в большом количестве организмов - Археи или архебактерии, бактерии, фаги, грибы, дрожжи, водоросли и некоторые растения. Они могут выражаться в разных отделах клетки - ядро, митохондрии или хлоропласты. Несколько сотен из них ферменты были идентифицированы.

Мегануклеазы в основном представлены двумя основными семействами ферментов, вместе известными как эндонуклеазы самонаведения: эндонуклеазами интронов и эндонуклеазами интеина.

В природе эти белки кодируются мобильными генетическими элементами, интроны или интеины. Интроны распространяются, вмешиваясь в точное место в ДНК, где экспрессия мегануклеазы вызывает разрыв в комплементарном интроне или свободном от интеина. аллель. Для интеинов и интронов группы I этот разрыв приводит к удвоению интрона или интеина на участке разрезания посредством гомологичная рекомбинация восстановление двухцепочечных разрывов ДНК.

Мы относительно мало знаем о реальном назначении мегануклеаз. Широко распространено мнение, что генетический материал, кодирующий мегануклеазы, функционирует как паразитический элемент, который использует механизмы репарации клеток двухцепочечной ДНК в своих интересах как средство размножения и распространения, не повреждая генетический материал своего хозяина.

Самонаводящиеся эндонуклеазы из семейства LAGLIDADG

Существует пять семейств или классов самонаводящихся эндонуклеаз.[1] Самым распространенным и известным является Семья LAGLIDADG. Эндонуклеазы семейства LAGLIDADG в основном обнаруживаются в митохондриях и хлоропластах эукариотических одноклеточных организмов.

Название этого семейства соответствует аминокислотной последовательности (или мотиву), которая более или менее консервативна во всех белках этого семейства. Эти небольшие белки также известны своими компактными и плотно упакованными трехмерными структурами.

К наиболее изученным эндонуклеазам, которые наиболее широко используются в исследованиях и геномной инженерии, относятся: I-SceI (обнаружен в митохондриях пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae), I-CreI (из хлоропластов зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii) и I-DmoI (из архебактерии Desulfurococcus mobilis).

Наиболее известными эндонуклеазами LAGLIDADG являются гомодимеры (например, I-CreI, состоящий из двух копий одного и того же белкового домена) или внутренне симметричные мономеры (I-SceI). Сайт связывания ДНК, содержащий каталитический домен, состоит из двух частей по обе стороны от точки разреза. Сайты полусвязывания могут быть очень похожими и связываться с палиндромной или полупалиндромной последовательностью ДНК (I-CreI), или они могут быть непалиндромными (I-SceI).

Как инструменты для геномной инженерии

Высокая специфичность мегануклеаз дает им высокую точность и гораздо более низкую клеточную токсичность, чем другие природные рестрикционные ферменты. Мегануклеазы были обнаружены в 1990-х годах, и последующая работа показала, что они являются особенно многообещающими инструментами для геномная инженерия и редактирование генов, поскольку они способны эффективно индуцировать гомологичную рекомбинацию,[2] генерировать мутации,[3] и изменить рамки чтения.[4]

Однако генетические рекомбинации, индуцированные мегануклеазами, которые могли быть выполнены, были ограничены репертуаром доступных мегануклеаз. Несмотря на существование в природе сотен мегануклеаз и тот факт, что каждая из них способна переносить незначительные вариации в своем сайте узнавания, вероятность обнаружения мегануклеазы, способной разрезать данный ген в желаемом месте, чрезвычайно мала. Несколько групп обратили свое внимание на разработку новых мегануклеаз, нацеленных на желаемые сайты узнавания.

Наиболее продвинутые исследования и приложения касаются самонаводящихся эндонуклеаз из семейства LAGLIDADG.

Для создания специально созданных мегануклеаз используются два основных подхода:

  • Изменение специфичности существующих мегануклеаз путем введения небольшого количества вариаций в аминокислотную последовательность и последующего отбора функциональных белков на вариациях естественного сайта узнавания.[5][6][7]
  • Более радикальным вариантом было использование свойства, которое играет важную роль в естественной высокой степени диверсификации мегануклеаз: возможность связывания или слияния белковых доменов от разных ферментов.[8][9] Этот вариант позволяет разрабатывать химерные мегануклеазы с новым сайтом узнавания, состоящим из половины сайта мегануклеазы A и половины сайта белка B. Путем слияния белковых доменов I-DmoI и I-CreI две химерные мегануклеазы имеют были созданы с использованием этого метода: E-Drel и DmoCre.[10]

Эти два подхода можно комбинировать, чтобы увеличить возможность создания новых ферментов при сохранении высокой степени эффективности и специфичности. Ученые из Cellectis работают над редактированием генов с 1999 года и разработали коллекцию из более чем 20 000 белковых доменов из гомодимерной мегануклеазы I-CreI, а также из каркасов других мегануклеаз.[11] Их можно комбинировать с образованием функциональных химерных гетеродимеров для исследовательских лабораторий и промышленных целей.

Precision Biosciences, еще одна биотехнологическая компания, разработала полностью рациональный процесс проектирования под названием «Редактор направленных нуклеаз» (DNE), который позволяет создавать сконструированные мегануклеазы, нацеленные на определенное пользователем место в геноме и изменяющие его.[12] В 2012 году исследователи из Bayer CropScience использовали DNE для включения последовательности гена в ДНК растений хлопка, направляя ее точно в заданный участок.[13]

Дополнительные приложения

Одним из недавних достижений в использовании мегануклеаз для геномной инженерии является включение ДНК-связывающего домена из эффекторы, подобные активатору транскрипции (TAL) в гибридные нуклеазы. Эти «мегаталлы» сочетают в себе простоту конструирования и высокую специфичность связывания ДНК эффектора TAL с высокой эффективностью расщепления мегануклеаз.[14] Кроме того, мегануклеазы были слиты с ферментами, обрабатывающими концы ДНК, чтобы повысить вероятность ошибок. негомологичное соединение концов[15] и увеличить частоту мутагенных событий в данном локусе.[16]

Вероятности

Как указано в первом абзаце, мегануклеаза с последовательностью из 18 пар оснований в среднем потребует, чтобы геном в двадцать раз превышал размер человеческого генома один раз случайно; расчет 418/ 3x109 = 22,9. Однако очень похожие последовательности встречаются гораздо чаще, и чем быстрее частота увеличивается, тем больше разрешается несоответствий.

Например, последовательность, которая идентична для всех пар оснований, кроме одной, может случайно встречаться каждые 417/ 18x3x109 = 0,32 эквивалента генома человека в среднем, или три раза на геном человека. Последовательность, которая идентична во всех парах оснований, кроме двух, в среднем встречается случайно каждые 416/ (18C2) x3x109 = 0,0094 эквивалента генома человека, или 107 раз на геном человека.

Это важно, потому что ферменты не обладают идеальным различением; нуклеаза все еще будет иметь некоторую вероятность действовать, даже если последовательность не совпадает полностью. Таким образом, активность нуклеазы в последовательности с одним несоответствием равна меньше чем в случае отсутствия несовпадений, и активность даже меньше для двух несовпадений, но все же не равна нулю. Исключение этих последовательностей, которые очень похожи, но не идентичны, по-прежнему является важной проблемой, которую необходимо преодолеть в геномной инженерии.

Прочие соображения

Метилирование ДНК и структура хроматина влияют на эффективность переваривания мегануклеаз.[17][18] Таким образом, для практического применения этих ферментов необходимо тщательное рассмотрение генетического и эпигенетического контекста последовательности-мишени.

В декабре 2014 г. USPTO выдал патент 8921332, охватывающий редактирование генома на основе мегануклеаз in vitro.[19] Лицензия на этот патент была выдана исключительно компании Cellectis.[20]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Стоддард, Барри Л. (2006). «Строение и функция самонаводящейся эндонуклеазы». Ежеквартальные обзоры биофизики. 38 (1): 49–95. Дои:10.1017 / S0033583505004063. PMID 16336743.
  2. ^ Эпинат, Жан-Шарль; Арну, Сильвен; Чеймс, Патрик; Роша, Паскаль; Desfontaines, Доминик; Пузин, Клеманс; Патен, Амели; Зангеллини, Александр; Пак, Фредерик (01.06.2003). «Новая сконструированная мегануклеаза вызывает гомологичную рекомбинацию в клетках дрожжей и млекопитающих». Исследования нуклеиновых кислот. 31 (11): 2952–2962. Дои:10.1093 / nar / gkg375. ISSN 1362-4962. ЧВК 156710. PMID 12771221.
  3. ^ Арну, Сильвен; Перес, Кристоф; Кабаньольс, Жан-Пьер; Смит, Джулианна; Губль, Аньес; Гризо, Сильвестр; Эпинат, Жан-Шарль; Дюклер, Эймерик; Дюшато, Филипп (2007-08-03). «Сконструированные производные I-CreI, отщепляющие последовательности гена XPC человека, могут вызывать высокоэффективную генную коррекцию в клетках млекопитающих». Журнал молекулярной биологии. 371 (1): 49–65. Дои:10.1016 / j.jmb.2007.04.079. ISSN 0022-2836. PMID 17561112.
  4. ^ Chapdelaine, P .; Pichavant, C .; Rousseau, J .; Pâques, F .; Тремблей, Дж. П. (01.07.2010). «Мегануклеазы могут восстанавливать рамку считывания мутировавшего дистрофина». Генная терапия. 17 (7): 846–858. Дои:10.1038 / gt.2010.26. ISSN 1476-5462. PMID 20393509.
  5. ^ Селигман, Л. М .; Чисхолм, км; Шевалье, бакалавр наук; Чадси, MS; Эдвардс, ST; Savage, JH; Veillet, AL (2002). «Мутации, изменяющие специфичность расщепления самонаводящейся эндонуклеазы». Исследования нуклеиновых кислот. 30 (17): 3870–9. Дои:10.1093 / nar / gkf495. ЧВК 137417. PMID 12202772.
  6. ^ Суссман, Джанго; Чадси, Мэг; Кран, Стив; Энгель, Алекс; Брутт, Анна; Моннат, Рэй; Стоддард, Барри Л .; Селигман, Ленни М. (2004). «Выделение и характеристика специфичности новых самонаводящихся эндонуклеаз в положениях отдельных целевых сайтов». Журнал молекулярной биологии. 342 (1): 31–41. Дои:10.1016 / j.jmb.2004.07.031. PMID 15313605.
  7. ^ Rosen, L.E .; Morrison, H.A .; Masri, S .; Браун, М. Дж .; Springstubb, B .; Sussman, D .; Stoddard, B.L .; Селигман, Л. М. (2006). «Самонаводящиеся производные эндонуклеазы I-CreI с новой специфичностью ДНК-мишени». Исследования нуклеиновых кислот. 34 (17): 4791–800. Дои:10.1093 / нар / gkl645. ЧВК 1635285. PMID 16971456.
  8. ^ Арну, Сильвен; Чеймс, Патрик; Перес, Кристоф; Лакруа, Эммануэль; Дюклер, Эймерик; Эпинат, Жан-Шарль; Стричер, Франсуа; Пети, Анн-Софи; Патен, Амели (2006). «Разработка большого количества высокоспецифичных самонаводящихся эндонуклеаз, которые индуцируют рекомбинацию на новых мишенях ДНК». Журнал молекулярной биологии. 355 (3): 443–58. Дои:10.1016 / j.jmb.2005.10.065. PMID 16310802.
  9. ^ Smith, J .; Grizot, S .; Arnould, S .; Duclert, A .; Epinat, J.-C .; Chames, P .; Prieto, J .; Redondo, P .; Бланко, Ф. Дж. (2006). «Комбинаторный подход к созданию эндонуклеаз искусственного самонаведения, расщепляющих выбранные последовательности». Исследования нуклеиновых кислот. 34 (22): e149. Дои:10.1093 / нар / gkl720. ЧВК 1702487. PMID 17130168.
  10. ^ Chevalier, Brett S .; Кортемме, Таня; Chadsey, Meggen S .; Бейкер, Дэвид; Monnat, Raymond J .; Стоддард, Барри Л. (2002). «Дизайн, активность и структура высокоспецифической искусственной эндонуклеазы». Молекулярная клетка. 10 (4): 895–905. Дои:10.1016 / S1097-2765 (02) 00690-1. PMID 12419232.
  11. ^ Grizot, S .; Epinat, J.C .; Thomas, S .; Duclert, A .; Rolland, S .; Paques, F .; Дюшато, П. (2009). «Создание модифицированных самонаводящихся эндонуклеаз, содержащих ДНК-связывающие домены, полученные из двух разных каркасов». Исследования нуклеиновых кислот. 38 (6): 2006–18. Дои:10.1093 / нар / gkp1171. ЧВК 2847234. PMID 20026587.
  12. ^ Гао, Хуйжун; Смит, Джефф; Ян, Мэйчжу; Джонс, Спенсер; Джуканович, Весна; Николсон, Майкл Дж .; Запад, Анд; Бидни, Деннис; Фалько, С. Карл (2010). «Наследственный целевой мутагенез кукурузы с использованием разработанной эндонуклеазы». Журнал растений. 61 (1): 176–87. Дои:10.1111 / j.1365-313X.2009.04041.x. PMID 19811621.
  13. ^ http://www.research.bayer.com/en/straight-into-the-cotton-genome.aspx[требуется полная цитата]
  14. ^ Буассель, Сандрин; Джарджур, Иордания; Астрахань, Александр; Адей, Эндрю; Губль, Аньес; Дюшато, Филипп; Шендуре, Джей; Стоддард, Барри Л .; Черто, Майкл Т. (01.02.2014). «MegaTALs: архитектура нуклеаз с редким расщеплением для терапевтической геномной инженерии». Исследования нуклеиновых кислот. 42 (4): 2591–2601. Дои:10.1093 / nar / gkt1224. ISSN 1362-4962. ЧВК 3936731. PMID 24285304.
  15. ^ Черто, Майкл Т; Gwiazda, Kamila S; Кухар, Райан; Сезер, Блайт; Куринга, Габриель; Мандт, Тайлер; Браулт, Мишель; Ламберт, Эбигейл Р.; Бакстер, Сара К. (01.10.2012). «Связывание эндонуклеаз с ферментами, обрабатывающими концы ДНК, для разрушения генов». Природные методы. 9 (10): 973–975. Дои:10.1038 / nmeth.2177. ISSN 1548-7091. ЧВК 3602999. PMID 22941364.
  16. ^ Делакот, Фабьен; Перес, Кристоф; Гайо, Валери; Дюамель, Марианна; Рошон, Кристель; Оливье, Натали; Макмастер, Рэйчел; Сильва, Джордж Х .; Пак, Фредерик (1 января 2013 г.). «Высокочастотный целевой мутагенез с использованием сконструированных эндонуклеаз и ферментов, обрабатывающих концы ДНК». PLOS ONE. 8 (1): e53217. Дои:10.1371 / journal.pone.0053217. ISSN 1932-6203. ЧВК 3554739. PMID 23359797.
  17. ^ Валтон, Жюльен; Дабусси, Файза; Ледюк, Софи; Молина, Рафаэль; Редондо, Пилар; Макмастер, Рэйчел; Монтойя, Гильермо; Дюшато, Филипп (31 августа 2012 г.). «Метилирование 5'-цитозин-фосфогуанина (CpG) влияет на активность природных и искусственных мегануклеаз». Журнал биологической химии. 287 (36): 30139–30150. Дои:10.1074 / jbc.M112.379966. ISSN 0021-9258. ЧВК 3436367. PMID 22740697.
  18. ^ Дабусси, Файза; Заславский, Михаил; Пуаро, Лоран; Лоперфидо, Мариана; Губль, Аньес; Гайо, Валери; Ледюк, Софи; Галетто, Роман; Гризо, Сильвестр (29 марта 2012). «Хромосомный контекст и эпигенетические механизмы контролируют эффективность редактирования генома редкими дизайнерскими эндонуклеазами». Исследования нуклеиновых кислот. 40 (13): 6367–6379. Дои:10.1093 / нар / гкс268. ISSN 0305-1048. ЧВК 3401453. PMID 22467209.
  19. ^ «Патент США на хромосомную модификацию, включающую индукцию расщепления двухцепочечной ДНК и гомологичную рекомбинацию на участке расщепления. Патент (патент № 8,921,332, выданный 30 декабря 2014 г.) - Justia Patents Search». patents.justia.com. Получено 2016-02-19.
  20. ^ "Cellectis объявляет о выдаче USPTO патента на метод" редактирования генов "на основе семенной нуклеазы | cellectis". www.cellectis.com. Архивировано из оригинал на 2016-03-02. Получено 2016-02-19.

внешняя ссылка