WikiDer > Микродиализ

Microdialysis
Зонды для микродиализа производства CMA Microdialysis AB, Киста, Швеция

Микродиализ это минимально инвазивный метод отбора проб, который используется для непрерывного измерения концентрации свободных, несвязанных аналитов в внеклеточный жидкость практически любой ткани. Аналиты могут включать эндогенные молекулы (например, нейротрансмиттер, гормоны, глюкозаи т. д.) для оценки их биохимических функций в организме или экзогенных соединений (например, фармацевтические препараты) для определения их распределения в организме. Техника микродиализа требует введения небольшого катетера для микродиализа (также называемого зондом микродиализа) в интересующую ткань. Зонд для микродиализа имитирует кровеносный капилляр и состоит из стержня с полупроницаемый мембрана из полых волокон на ее конце, которая соединена с впускной и выпускной трубками. Зонд постоянно перфузированный с водным раствором (перфузатом), который очень напоминает (ионный) состав окружающей тканевой жидкости при низкой скорости потока примерно 0,1-5 мкл / мин.[1] После попадания в интересующую ткань или (тело) жидкость небольшие растворенные вещества могут проходить через полупроницаемую мембрану посредством пассивного распространение. Направление потока аналита определяется соответствующим градиентом концентрации и позволяет использовать зонды микродиализа в качестве инструментов для отбора проб и доставки.[1] Раствор, покидающий зонд (диализат), собирается через определенные промежутки времени для анализа.

История

Принцип микродиализа был впервые использован в начале 1960-х годов, когда пушпульные канюли[2] и диализные мешки[3] были имплантированы в ткани животных, особенно в мозг грызунов, для непосредственного изучения биохимии тканей.[1] Хотя эти методы имели ряд экспериментальных недостатков, таких как количество образцов на животное или отсутствие / ограниченное временное разрешение, изобретение дилитродов с непрерывной перфузией в 1972 году помогло преодолеть некоторые из этих ограничений.[4] Дальнейшее усовершенствование концепции диалитрода привело к изобретению в 1974 году «полого волокна», трубчатой ​​полупроницаемой мембраны диаметром ~ 200-300 мкм.[5] Наиболее распространенная на сегодняшний день форма - игольчатый зонд - состоит из стержня с полым волокном на конце и может быть введен с помощью направляющей канюли в мозг и другие ткани.

Зонды для микродиализа

Схематическое изображение зонд для микродиализа

Доступны различные датчики с различными комбинациями длины мембраны и вала. Предельная молекулярная масса коммерчески доступных зондов для микродиализа охватывает широкий диапазон приблизительно от 6 до 100 кДа, но также доступен 1MD. В то время как водорастворимые соединения обычно свободно диффундируют через мембрану микродиализа, ситуация не так ясна для высоколипофильных аналитов, где сообщалось как об успешных (например, кортикостероиды), так и неудачных экспериментах по микродиализу (например, эстрадиол, фузидовая кислота).[6] Однако извлечение водорастворимых соединений обычно быстро снижается, если молекулярная масса анализируемого вещества превышает 25% предельной молекулярной массы мембраны.

Методы восстановления и калибровки

Из-за постоянного перфузия зонд для микродиализа со свежим перфузатом, полное равновесие не может быть установлено.[1] Это приводит к тому, что концентрации диализата ниже, чем измеренные на удаленном участке отбора проб. Для того чтобы соотнести концентрации, измеренные в диализате, с концентрациями, присутствующими в удаленном месте отбора проб, необходим калибровочный коэффициент (восстановление). Извлечение можно определить в установившемся режиме, используя постоянную скорость обмена аналита через мембрану микродиализа. Скорость, с которой аналит обменивается через полупроницаемую мембрану, обычно выражается как эффективность экстракции аналита. Эффективность экстракции определяется как отношение потерь / прироста аналита во время его прохождения через зонд (Cв−Cиз) и разница в концентрации между перфузатом и удаленным местом отбора проб (Cв−Cобразец).

Теоретически эффективность экстракции микродиализного зонда может быть определена: 1) изменением концентраций лекарственного средства при сохранении постоянной скорости потока или 2) изменением скорости потока при сохранении постоянных соответствующих концентраций лекарства. В установившемся режиме достигается одно и то же значение эффективности экстракции независимо от того, обогащен ли аналит перфузатом или истощен.[1] Следовательно, зонды для микродиализа могут быть откалиброваны либо путем измерения потери аналита с использованием перфузата, содержащего лекарственное средство, либо путем измерения увеличения количества аналита с использованием растворов образцов, содержащих лекарство. На сегодняшний день наиболее часто используемыми методами калибровки являются метод низкого расхода, метод отсутствия чистого потока,[7] динамический (расширенный) метод no-net-flux,[8] и метод ретродиализа.[9] Правильный выбор подходящего метода калибровки критически важен для успеха эксперимента по микродиализу. Поддерживающий in vitro Поэтому перед применением на животных или людях рекомендуется провести эксперименты.[1] Кроме того, восстановление, определенное in vitro, может отличаться от восстановления у людей. Поэтому его фактическое значение необходимо определять в каждом эксперименте in vivo.[6]

Метод с низким расходом

Метод с низким расходом основан на том факте, что эффективность экстракции зависит от расхода. При высоких скоростях потока количество лекарственного средства, диффундирующего из места отбора проб в диализат за единицу времени, меньше (низкая эффективность экстракции), чем при более низких скоростях потока (высокая эффективность экстракции). При нулевом расходе устанавливается полное равновесие между этими двумя участками (Cиз = Cобразец). Эта концепция применяется для метода (низкой) скорости потока, когда зонд перфузируется холостым перфузатом с разной скоростью потока. Концентрация в месте отбора проб может быть определена путем построения графиков соотношений экстракции в зависимости от соответствующих расходов и экстраполяции на нулевой поток. Метод с низким расходом ограничен тем фактом, что время калибровки может занять довольно много времени, прежде чем будет собран достаточный объем пробы.[нужна цитата]

Метод без чистых потоков

Во время калибровки методом no-net-flux-зонд для микродиализа перфузируется по меньшей мере четырьмя различными концентрациями интересующего аналита (Cв) и установившиеся концентрации аналита, покидающего зонд, измеряются в диализате (Cиз).[7] Восстановление для этого метода можно определить, построив график Cиз−Cв над Cв и вычисление наклона линии регрессии. Если концентрации анализируемого вещества в перфузате равны концентрациям в месте отбора пробы, происходит отсутствие чистого потока. Соответствующие концентрации в точке отсутствия чистого потока представлены отрезком x линии регрессии. Сила этого метода состоит в том, что в установившемся режиме не нужно делать никаких предположений о поведении соединения в непосредственной близости от зонда, поскольку равновесие существует в определенное время и в определенном месте.[6] Однако в переходных условиях (например, после провокации лекарством) восстановление зонда может измениться, что приведет к смещению оценок концентраций в месте отбора проб. Чтобы преодолеть это ограничение, было разработано несколько подходов, которые также применимы в нестационарных условиях. Один из таких подходов - метод динамического отсутствия чистых потоков.[8]

Метод динамического отсутствия чистых потоков

В то время как один субъект / животное перфузируется несколькими концентрациями во время метода без чистого потока, несколько субъектов перфузируются с одной концентрацией во время метода динамического отсутствия потока (DNNF).[8] Затем данные от различных субъектов / животных объединяются в каждый момент времени для регрессионного анализа, позволяющего определить восстановление с течением времени. Дизайн метода калибровки DNNF оказался очень полезным для исследований, которые оценивают реакцию эндогенных соединений, таких как нейротрансмиттеры, на лекарственное воздействие.[8]

Ретродиализ

Во время ретродиализа зонд микродиализа перфузируется раствором, содержащим анализируемое вещество, и отслеживается исчезновение лекарства из зонда. Восстановление для этого метода может быть рассчитано как отношение потери лекарства во время прохождения (Cв−Cиз) и лекарство, попадающее в зонд микродиализа (Cв). В принципе, ретродиализ можно проводить с использованием либо самого анализируемого вещества (ретродиализ с помощью лекарственного средства), либо эталонного соединения (ретродиализ с помощью калибратора), которое по своим физико-химическим и биологическим свойствам очень близко к аналиту.[9] Несмотря на то, что ретродиализ с помощью лекарств нельзя использовать для эндогенных соединений, поскольку он требует отсутствия аналита в месте отбора пробы, этот метод калибровки чаще всего используется для экзогенных соединений в клинических условиях.[1]

Приложения

Техника микродиализа претерпела большое развитие с момента ее первого использования в 1972 году.[4] когда его впервые применили для мониторинга концентрации эндогенных биомолекул в головном мозге.[10] Сегодняшняя область применения расширилась до мониторинга свободных концентраций как эндогенных, так и экзогенных соединений практически в любой ткани. Хотя микродиализ по-прежнему в основном используется в доклинических исследованиях на животных (например, на лабораторных грызунах, собаках, овцах, свиньях), в настоящее время он все чаще используется у людей для мониторинга концентраций свободных, несвязанных лекарственных средств в тканях, а также межуточных концентраций регуляторных цитокинов и метаболитов в ответ на нарушения гомеостаза, такие как кормление и / или упражнения.[11]

При исследовании мозга микродиализ обычно используется для измерения нейромедиаторов (например, дофамин, серотонин, норэпинефрин, ацетилхолин, глутамат, ГАМК) и их метаболиты, а также небольшие нейромодуляторы (например, лагерь, cGMP, НЕТ), аминокислоты (например. глицин, цистеин, тирозин) и энергетические субстраты (например, глюкоза, лактат, пируват). Экзогенные препараты, подлежащие анализу с помощью микродиализа, включают новые антидепрессанты, нейролептики, а также антибиотики и многие другие препараты, фармакологическое действие которых находится в головном мозге. Первым неметаболитом, проанализированным методом микродиализа in vivo в человеческом мозге, был рифампицин.[12][13][14]

Применения в других органах включают кожу (оценка биодоступность и биоэквивалентность дерматологических препаратов местного применения),[15] и мониторинг концентрации глюкозы у пациентов с диабетом (внутрисосудистое или подкожное размещение зонда). Последний может даже быть включен в систему искусственной поджелудочной железы для автоматического введения инсулина.

Микродиализ также нашел все более широкое применение в исследованиях окружающей среды,[16] отбор проб различных соединений из сточных вод и почвенного раствора, включая сахариды,[17] ионы металлов,[18] микроэлементы, [19] органические кислоты,[20] и азот с низким молекулярным весом.[21] Учитывая разрушительный характер традиционных методов отбора проб почвы,[22] микродиализ может оценить потоки почвенных ионов, которые лучше отражают ненарушенную почвенную среду.

Критический анализ

Преимущества

  1. На сегодняшний день микродиализ - единственный in vivo метод отбора проб, позволяющий непрерывно контролировать концентрацию лекарств или метаболитов во внеклеточной жидкости практически любой ткани. В зависимости от конкретного применения, концентрацию аналита можно контролировать в течение нескольких часов, дней или даже недель. Концентрации свободных, несвязанных внеклеточных тканей во многих случаях представляют особый интерес, поскольку они напоминают фармакологически активные концентрации в месте действия или рядом с ним. Сочетание микродиализа с современными методами визуализации, такими как позитронно-эмиссионная томография, что дополнительно позволяет определять внутриклеточные концентрации.
  2. Введение зонда в точное место выбранной ткани дополнительно позволяет оценить градиенты внеклеточной концентрации, обусловленные активностью переносчика или другими факторами, такими как различия в перфузии. Поэтому он был предложен как наиболее подходящий метод для изучения распределения в тканях.
  3. Обмен аналита через полупроницаемую мембрану и постоянная замена жидкости для отбора проб свежим перфузатом предотвращает дренаж жидкости из места отбора проб, что позволяет отбирать пробы без потери жидкости. Следовательно, микродиализ можно использовать без нарушения условий ткани из-за локальной потери жидкости или артефактов давления, которые могут возникнуть при использовании других методов, таких как микроинъекция или двухтактная перфузия.
  4. Полупроницаемая мембрана предотвращает попадание клеток, клеточного мусора и белков в диализат. Из-за отсутствия белка в диализате очистка образца перед анализом не требуется, и ферментативное разложение не вызывает беспокойства.

Ограничения

  1. Несмотря на научные достижения в уменьшении размеров и более эффективных зондов для микродиализа, инвазивный характер этого метода по-прежнему создает некоторые практические и этические ограничения. Например, было показано, что имплантация зонда для микродиализа может изменить ткань морфология что приводит к нарушению микроциркуляции, скорости метаболизма или целостности физиологических барьеров, таких как гематоэнцефалический барьер.[23] В то время как острые реакции на введение зонда, такие как травмы имплантации, требуют достаточного времени на восстановление, дополнительные факторы, такие как некроз, воспалительные реакции,[11] или процессы заживления ран должны быть приняты во внимание для долгосрочного отбора проб, так как они могут повлиять на результат эксперимента. С практической точки зрения было предложено проводить эксперименты по микродиализу в оптимальном временном окне, обычно через 24–48 часов после введения зонда.[24][25]
  2. Микродиализ имеет относительно низкое временное и пространственное разрешение по сравнению, например, с электрохимическим. биосенсоры. В то время как временное разрешение определяется длиной интервалов выборки (обычно несколько минут), пространственное разрешение определяется размерами зонда. Размер зонда может варьироваться в зависимости от области применения и охватывает диапазон от нескольких миллиметров (внутримозговое применение) до нескольких сантиметров (подкожный аппликации) длиной и несколько сотен микрометров в диаметре.[нужна цитата]
  3. Применение метода микродиализа часто ограничивается определением восстановления зонда, особенно для in vivo эксперименты. Определение выздоровления может занять много времени и может потребоваться дополнительные испытуемые или пилотные эксперименты. Восстановление во многом зависит от скорости потока: чем ниже скорость потока, тем выше выход. Однако на практике скорость потока нельзя уменьшить слишком сильно, поскольку либо объем пробы, полученный для анализа, будет недостаточным, либо временное разрешение эксперимента будет потеряно. Поэтому важно оптимизировать взаимосвязь между скоростью потока и чувствительностью аналитического анализа. Ситуация может быть более сложной для липофильных соединений, поскольку они могут прилипать к трубке или другим компонентам зонда, что приводит к низкому извлечению аналита или его отсутствию.[нужна цитата]

Рекомендации

  1. ^ а б c d е ж грамм Chaurasia CS, Müller M, Bashaw ED, Benfeldt E, Bolinder J, Bullock R, Bungay PM, DeLange EC, Derendorf H, Elmquist WF, Hammarlund-Udenaes M, Joukhadar C, Kellogg DL, Lunte CE, Nordstrom CH, Rollema H, Sawchuk RJ, Cheung BW, Shah VP, Stahle L, Ungerstedt U, Welty DF, Yeo H (май 2007 г.). «Белая книга семинара AAPS-FDA: принципы микродиализа, применение и перспективы регулирования». Фармацевтические исследования. 24 (5): 1014–25. Дои:10.1007 / s11095-006-9206-z. PMID 17458685. S2CID 8087765.
  2. ^ «Труды физиологического общества». Журнал физиологии. 155: 1–28. 1961. Дои:10.1113 / jphysiol.1961.sp006651.
  3. ^ Бито Л., Дэвсон Х, Левин Э, Мюррей М., Снайдер Н. (ноябрь 1966 г.). «Концентрации свободных аминокислот и других электролитов в спинномозговой жидкости, диализате головного мозга in vivo и плазме крови собаки». Журнал нейрохимии. 13 (11): 1057–67. Дои:10.1111 / j.1471-4159.1966.tb04265.x. PMID 5924657. S2CID 32976369.
  4. ^ а б Дельгадо Дж. М., ДеФеудис Ф. В., Рот Р. Х., Рюго Д. К., Митрука Б. М. (1972). «Диалитрод для долговременной внутримозговой перфузии у бодрствующих обезьян». Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Thérapie. 198 (1): 9–21. PMID 4626478.
  5. ^ Ungerstedt U, Pycock C (июль 1974 г.). «Функциональные корреляты нейротрансмиссии дофамина». Bulletin der Schweizerischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften. 30 (1–3): 44–55. PMID 4371656.
  6. ^ а б c Шталь М., Боу Р., Джексон А., Пей В. (июнь 2002 г.). «Микродиализ человека». Текущая фармацевтическая биотехнология. 3 (2): 165–78. Дои:10.2174/1389201023378373. PMID 12022259.
  7. ^ а б Lönnroth P, Jansson PA, Smith U (август 1987 г.). «Метод микродиализа, позволяющий характеризовать межклеточное водное пространство у человека». Американский журнал физиологии. 253 (2, ч. 1): E228-31. Дои:10.1152 / ajpendo.1987.253.2.E228. PMID 3618773.
  8. ^ а б c d Олсон Р. Дж., Джастис Дж. Б. (2002). «Количественный микродиализ в переходных условиях». Аналитическая химия. 65 (8): 1017–1022. Дои:10.1021 / ac00056a012. PMID 8494171.
  9. ^ а б Ван И, Вонг С.Л., Савчук Р.Дж. (октябрь 1993 г.). «Калибровка микродиализа с использованием ретродиализа и нулевого потока: приложение к исследованию распределения зидовудина в спинномозговой жидкости и таламусе кроликов». Фармацевтические исследования. 10 (10): 1411–9. Дои:10.1023 / А: 1018906821725. PMID 8272401. S2CID 20232288.
  10. ^ Бенвенисте H, Hüttemeier PC (1990). «Микродиализ - теория и применение». Прогресс в нейробиологии. 35 (3): 195–215. Дои:10.1016 / 0301-0082 (90) 90027-Е. PMID 2236577. S2CID 29998649.
  11. ^ а б Карсон Б.П., Маккормак РГ, Конвей К., Кук Дж., Сондерс Дж., О'Коннор В.Т., Джейкман П.М. (февраль 2015 г.). «Характеристика микродиализа in vivo кратковременных изменений в интерстициальной концентрации метаболитов и цитокинов в диализате в скелетных мышцах человека в ответ на введение зонда микродиализа». Цитокин. 71 (2): 327–33. Дои:10.1016 / j.cyto.2014.10.022. PMID 25528289.
  12. ^ Миндерманн Т., Циммерли В., Грацл О. (октябрь 1998 г.). «Концентрации рифампицина в различных отделах головного мозга человека: новый метод определения уровней лекарств в церебральном внеклеточном пространстве». Противомикробные препараты и химиотерапия. 42 (10): 2626–9. Дои:10.1128 / aac.42.10.2626. ЧВК 105908. PMID 9756766.
  13. ^ Мюллер М., дела Пенья А., Дерендорф Х. (май 2004 г.). «Вопросы фармакокинетики и фармакодинамики противоинфекционных средств: распределение в тканях». Противомикробные препараты и химиотерапия. 48 (5): 1441–53. Дои:10.1128 / aac.48.5.1441-1453.2004. ЧВК 400530. PMID 15105091.
  14. ^ Чефер В.И., Томпсон А.С., Сапата А., Шиппенберг Т.С. (апрель 2009 г.). «Обзор микродиализа мозга». Текущие протоколы в неврологии. Глава 7: 7.1.1–7.1.28. Дои:10.1002 / 0471142301.ns0701s47. ЧВК 2953244. PMID 19340812.
  15. ^ Шмидт С., Бэнкс Р., Кумар В., Рэнд К. Х., Дерендорф Н. (март 2008 г.). «Клинический микродиализ кожи и мягких тканей: обновленная информация». Журнал клинической фармакологии. 48 (3): 351–64. Дои:10.1177/0091270007312152. PMID 18285620. S2CID 12379638.
  16. ^ Миро М, Френзель В (2005). «Возможности микродиализа как метода автоматической обработки проб для исследования окружающей среды». Тенденции TrAC в аналитической химии. 24 (4): 324–333. Дои:10.1016 / j.trac.2004.10.004.
  17. ^ Торто Н., Лобело Б., Гортон Л. (2000). «Определение сахаридов в сточных водах производства напитков с помощью микродиализного отбора проб, микроканальной высокоэффективной анионообменной хроматографии и интегрированного импульсного электрохимического обнаружения». Аналитик. 125 (8): 1379–1381. Bibcode:2000Ана ... 125.1379Т. Дои:10.1039 / b004064i.
  18. ^ Torto N, Mwatseteza J, Sawula G (2002). «Исследование микродиализного отбора проб ионов металлов». Analytica Chimica Acta. 456 (2): 253–261. Дои:10.1016 / S0003-2670 (02) 00048-X.
  19. ^ Хамфри, О. С., Янг, С. Д., Краут, Н. М., Бейли, Э. Х., Андер, Э. Л., и Уоттс, М. Дж. (2020). Краткосрочная динамика йода в почвенном растворе. Наука об окружающей среде и технологии, 54 (3), 1443-1450.
  20. ^ Сулек М., Миро М., Стингедер Г., Коелленспергер Г. (август 2005 г.). «Возможности проточного микродиализа для исследования низкомолекулярных органических анионов в почвенном растворе ризосферы». Analytica Chimica Acta. 546 (1): 1–10. Дои:10.1016 / j.aca.2005.05.027. PMID 29569545.
  21. ^ Инселсбахер, Эрих; Олунд, Йонас; Ямтгард, Сандра; Хус-Данелл, Керстин; Näsholm, Torgny (2011). «Возможности микродиализа для мониторинга органических и неорганических соединений азота в почве». Биология и биохимия почвы. 43 (6): 1321–1332. Дои:10.1016 / j.soilbio.2011.03.003.
  22. ^ Inselsbacher, Эрих (2014). «Восстановление индивидуальных форм азота почвы после просеивания и экстракции». Биология и биохимия почвы. 71: 76–86. Дои:10.1016 / j.soilbio.2014.01.009.
  23. ^ Морган М.Э., Сингхал Д., Андерсон Б.Д. (май 1996 г.). «Количественная оценка повреждения гематоэнцефалического барьера при микродиализе». Журнал фармакологии и экспериментальной терапии. 277 (2): 1167–76. PMID 8627529.
  24. ^ Ди Кьяра Дж., Танда Дж., Карбони Е. (ноябрь 1996 г.). «Оценка высвобождения нейротрансмиттеров in vivo с помощью микродиализа мозга: вопрос достоверности». Поведенческая фармакология. 7 (7): 640–657. Дои:10.1097/00008877-199611000-00009. PMID 11224460.
  25. ^ Damsma G, Westerink BH, Imperato A, Rollema H, de Vries JB, Horn AS (август 1987 г.). «Автоматический диализ ацетилхолина головного мозга у свободно движущихся крыс: определение базального ацетилхолина». Науки о жизни. 41 (7): 873–6. Дои:10.1016/0024-3205(87)90695-3. PMID 3613848.