WikiDer > SmURFP - Википедия

SmURFP - Wikipedia
Флуоресцентные белки визуализируют развитие клеточного цикла. Флуоресценция IFP2.0-hGem (1/110) показана зеленым и выделяет S / G2/ М фаз. Флуоресценция smURFP-hCdtI (30/120) показана красным цветом и выделена буквой G0/ГРАММ1 фазы.

Малый ультра-красный флуоресцентный белок (smURFP) - класс дальних красных флуоресцентный белок развился из цианобактерий (Trichodesmium erythraeum) фикобилипротеин, α-аллофикоцианин.[1][2] Родной α-аллофикоцианин требуется экзогенный белок, известный как лиазе, чтобы прикрепить хромофор, фикоцианобилин. Фикоцианобилин не присутствует в млекопитающее клетки. smURFP был преобразован в ковалентно прикреплять фикоцианобилин без лиазе и флуоресценция, ковалентно прикреплять биливердин (повсеместно млекопитающее клетки) и флуоресценция, синее смещение флуоресценция чтобы соответствовать органическому флуорофор, Cy5, а не подавлять Кишечная палочка рост. smURFP был обнаружен после 12 раундов случайного мутагенеза и ручного скрининга 10 000 000 бактериальный колонии.

Характеристики

smURFP - гомодимер с поглощение и выброс максимум 642 нм и 670 нм соответственно. Был создан тандемный димер smURFP (TDsmURFP), который имеет свойства, аналогичные smURFP. smURFP чрезвычайно стабилен с деградация белка период полураспада 17 часов и 33 часа без и с хромофор (биливердин), соответственно. Это сопоставимо с медуза-производный усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP) деградация белка период полураспада 24 часа.[3] smURFP чрезвычайно фотостабилен и не работает мЧерри[4] и tdTomato[4] в живых клетках. В коэффициент экстинкции (180 000 млн−1 см−1) smURFP чрезвычайно велик и имеет скромную квантовый выход (0,20), что делает его биофизическую яркость сопоставимой с eGFP и ~ в 2 раза ярче, чем большинство красных или дальних красных флуоресцентные белки происходит от коралл. Несмотря на то, что они гомодимеры, все протестированные N- и C-концевые слияния показать правильную клеточную локализацию, в том числе сложную слияние к α-тубулин и Ламин B1 (Фигура).[1] smURFP назван в честь Смурфыиз-за его голубого цвета в белом свете.[1]

Лист Excel со спектрами поглощения, возбуждения и излучения smURFP можно скачать здесь. Кристаллическая структура мутанта smURFP (PDB: 6FZN) Был опубликован в Фуэнзалида-Вернер и др..[5] В обзоре 2020 года обсуждаются недавние применения smURFP в качестве генетически кодируемого или экзогенного зонда для in vivo изображения и обсуждает проблемы с биливердин доступность.[6]

Изображение показывает Кишечная палочка выражение smURFP, гранулирование Кишечная палочка, удаление медиа, Кишечная палочка лизис, связывание smURFP с NiNTA, элюция smURFP и замена буфера.

smURFP используется в качестве наночастиц, экзогенных зондов и in vitro анализы

Свободный smURFP имеет диаметр 2-3 нм. smURFP наночастицы диаметром ~ 10-14 нм могут быть синтезированы в масле и воде эмульсия и оставаться флуоресцентный. Эти флуоресцентный белок наночастицы стабильны у живых мышей и полезны для неинвазивный опухоль флуоресценция визуализация.[7]

Свободный smURFP, очищенный белок, не кодируемый генетически, может быть инкапсулирован в вирусы и используется для неинвазивный, флуоресценция изображение биораспределение у живых мышей.[8][9]

smURFP позволяет создавать in vitro анализы для обнаружения фермент Мероприятия. An проба был разработан для тромбин с диапазоном обнаружения 1,07–0,01 мМ и пределом обнаружения 0,2 аМ.[10]

Доступность хромофора в клетках и мышах

smURFP был генетически слит с ламином B1 человека, чтобы показать ядерную оболочку с флуоресценцией. Локализация белка Lamin B1 изменяется на разных фазах клеточного цикла.

Несмотря на сопоставимость биофизической яркости с eGFP когда очищен белок нормализовалось, в живую этого не наблюдалось клетки. Это говорит о том, что было недостаточно хромофор (биливердин) в клетки. Добавление биливердин повысился флуоресценция, но smURFP с биливердин не было сопоставимо с eGFP. Биливердин имеет два карбоксилаты на нейтральном pH и это препятствует проникновению в клетки. Диметиловый эфир биливердина больше гидрофобный аналог и легко пересекает сотовую мембрана. smURFP с диметиловый эфир биливердина показывает флуоресценцию, сравнимую с eGFP в клетки и ярче чем бактериальный фитохром флуоресцентные белки.

smURFP, экспрессируемый в культуре нейронов, не обнаруживает агрегации в лизосомах, как это наблюдалось с флуоресцентным белком, мЧерри.

У мышей smURFP флуоресценция виден в HT1080 опухоль ксенотрансплантаты без экзогенных биливердин, но флуоресценция меньше чем коралл-производный красный флуоресцентные белки, мЧерри[4] и mCardinal.[11] Видимый флуоресценция не всегда можно использовать флуоресценция и флуоресцентные белки всегда следует сравнивать с другими полезными, генетически закодированный флуоресцентные белки. Внутривенная инъекция экзогенного биливердин или же диметиловый эфир биливердина не увеличивается флуоресценция smURFP выражается в опухоли через 1-24 часа. Масс-спектрометрии показал, что сложноэфирные группы были быстро удалены из диметиловый эфир биливердина. Добавление 25 мкМ биливердин или же диметиловый эфир биливердина резко увеличился флуоресценция из вырезанный опухоли и smURFP присутствует без хромофор. Дальнейшие исследования необходимы для оптимизации хромофор наличие у мышей для получения флуоресценция сопоставимо или больше чем коралл-производный красный флуоресцентные белки.

Добавление хромофора в клетки

Диметиловый эфир биливердина, биливердин, и фикоцианобилин коммерчески доступны от Frontier Scientific. Диметиловый эфир биливердина, биливердин, или же фикоцианобилин растворяется в ДМСО в концентрация 5 мМ. Раствор очень темный, энергично наберите его пипеткой, чтобы все растворилось. Диметиловый эфир биливердина не растворяется в общем буферы, включая фосфатно-солевой буфер (PBS) или Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS). Добавить 1-5 мкМ диметиловый эфир биливердина в среде или буфере, содержащем 10% фетальная бычья сыворотка (FBS). Добавить 25 мкМ биливердин (не как проницаемый для мембраны) клетки. Биливердин не насыщает сайты smURFP и не достигает максимальной интенсивности флуоресценции. Диметиловый эфир биливердина следует использовать для получения максимальной интенсивности флуоресценции. Инкубируйте smURFP с хромофор как можно дольше, чтобы увеличить накопление белка, вызванное усиленным стабильность белка с хромофор. Покинуть хромофор рекомендуется минимум 3 часа 24 часа. Удалять хромофор, промыть средой, содержащей 10% FBS, а изображение в СМИ отсутствует фенол красный или изображения буфер.

генетически кодируемые биосенсоры smURFP

Дальний красный и ближний инфракрасный диапазон FUCCI визуализирует рождение многоядерных клеток, которые часто встречаются во многих раковых клетках.

Киназа FRET датчик. smURFP - полезный приемник для многих красных флуоресцентные белки из-за спектрального перекрытия. Рационально разработанный красный флуоресцентный белок stagRFP позволяет упростить создание FRET датчики. stagRFP является полезным донором FRET для дальнего красного акцептора smURFP и ERK киназа FRET Репортер был создан со средним откликом ~ 15%. Новый сенсор позволил одновременно визуализировать три киназы, Src, Акт, ERK, в одном клетка.[12]

 

Флуоресцентное изображение клеточный цикл. Новаторская работа Ацуши Мияваки и его сотрудников разработала флуоресцентный индикатор клеточного цикла на основе убиквитинирования (FUCCI), что позволяет флуоресценция визуализация клеточного цикла. Первоначально зеленый флуоресцентный белок, mAG, был слит с hGem (1/110) и оранжевым флуоресцентный белок (mKO2) был слит с hCdt1 (30/120). Обратите внимание, что эти слияния представляют собой фрагменты, содержащие сигнал ядерной локализации и убиквитинирование сайты для деградация, но не являются функциональными белками. В зеленый флуоресцентный белок производится во время S, G2, или фаза M и деградировала во время G0 или G1 фаза, а оранжевый флуоресцентный белок сделано во время G0 или G1 фазе и разрушается во время S, G2, или фаза М.[13] FUCCI в дальнем красном и ближнем инфракрасном диапазоне был разработан с использованием цианобактерии-полученный флуоресцентный белок (smURFP) и бактериофитохром-полученный флуоресцентный белок (фильм найден по этой ссылке).[1]

smURFP (голубой), выраженный в Кишечная палочка.


Рекомендации

  1. ^ а б c d Родригес, Эрик А .; Тран, Джеральдин Н .; Гросс, Ларри А.; Крисп, Джессика Л .; Шу, Сяокунь; Lin, John Y .; Цзянь, Роджер Ю. (2016-08-01). «Дальний красный флуоресцентный белок произошел из цианобактериального фикобилипротеина». Методы природы. 13 (9): 763–9. Дои:10.1038 / nmeth.3935. ISSN 1548-7105. ЧВК 5007177. PMID 27479328.
  2. ^ Патент США 20180201655A1, Родригес, Эрик А .; Джеральдин Н. Тран и Джон Ю. Лин и др., "Аллофикоцианин альфа-субъединица эволюционировала, маркирующие белки (smURFP).", Опубликовано 10 декабря 2019 г. 
  3. ^ Stack, J. H .; Whitney, M .; Rodems, S.M .; Поллок, Б.А. (2000-12-01). «Система мечения на основе убиквитина для контролируемой модуляции стабильности белка». Природа Биотехнологии. 18 (12): 1298–1302. Дои:10.1038/82422. ISSN 1087-0156. PMID 11101811. S2CID 23741831.
  4. ^ а б c Shaner, Натан С .; Кэмпбелл, Роберт Э .; Steinbach, Paul A .; Giepmans, Ben N.G .; Палмер, Эми Э .; Цзянь, Роджер Ю. (2004-12-01). «Улучшенные мономерные красные, оранжевые и желтые флуоресцентные белки, полученные из красного флуоресцентного белка Discosoma sp.». Природа Биотехнологии. 22 (12): 1567–1572. Дои:10.1038 / nbt1037. ISSN 1087-0156. PMID 15558047. S2CID 205272166.
  5. ^ Fuenzalida-Werner, JP; Яновский, Р. Мишра, К; Вайденфельд, я; Niessing, D; Ntziachristos, V; Stiel, AC (декабрь 2018 г.). «Кристаллическая структура фикобилипротеина, связанного с биливердином: взаимозависимость олигомеризации и хромофорилирования». Журнал структурной биологии. 204 (3): 519–522. Дои:10.1016 / j.jsb.2018.09.013. PMID 30287387.
  6. ^ Монтесинос-Франьола, Фелипе; Lin, John Y .; Родригес, Эрик А. (16 ноября 2020 г.). «Флуоресцентные белки для визуализации in vivo, где биливердин?». Сделки биохимического общества: BST20200444. Дои:10.1042 / BST20200444. ISSN 0300-5127.
  7. ^ Ан, Фейфей; Чен, Нанди; Конлон, Уильям Дж .; Хачи, Джастин С .; Синь, Цзинци; Арас, Омер; Родригес, Эрик А .; Тинг, Ричард (февраль 2020 г.). «Маленькие ультрафиолетовые флуоресцентные белковые наночастицы в качестве экзогенных зондов для неинвазивной визуализации опухолей in vivo». Международный журнал биологических макромолекул. 153: 100–106. Дои:10.1016 / j.ijbiomac.2020.02.253. PMID 32105698.
  8. ^ Герберт, Фабиан С .; Брохлин, Оливия; Гэлбрейт, Тайлер; Бенджамин, Кэндис; Reyes, Cesar A .; Лузуриага, Майкл А .; Шахриваркявишахи, Арезоо; Гассенсмит, Джеремайя Дж. (2020-04-03). «Супрамолекулярная инкапсуляция малых ультракрасных флуоресцентных белков в вирусоподобные наночастицы для неинвазивных агентов визуализации in vivo». Дои:10.26434 / chemrxiv.12067851.v1. Цитировать журнал требует | журнал = (помощь)
  9. ^ Герберт, Фабиан С .; Brohlin, Olivia R .; Гэлбрейт, Тайлер; Бенджамин, Кэндис; Reyes, Cesar A .; Лузуриага, Майкл А .; Шахриваркявишахи, Арезоо; Гассенсмит, Иеремия Дж. (07.05.2020). «Супрамолекулярная инкапсуляция малых ультракрасных флуоресцентных белков в вирусоподобные наночастицы для неинвазивных агентов визуализации in vivo». Биоконъюгат химия. 31 (5): 1529–1536. Дои:10.1021 / acs.bioconjchem.0c00190. ISSN 1043-1802. PMID 32343135.
  10. ^ Чжан, Хуаюе; Ян, Лу; Чжу, Сяцин; Ван, Яньян; Ян, Хайтао; Ван, Цефанг (13.05.2020). «Быстрый и сверхчувствительный биосенсор тромбина на основе рационально сконструированного трехфункционального белка». Передовые медицинские материалы. 9 (12): 2000364. Дои:10.1002 / adhm.202000364. ISSN 2192-2640. PMID 32406199.
  11. ^ Чу, Джун; Хейнс, Рассел Д.; Корбель, Стефан И .; Ли, Пэнпэн; Гонсалес-Гонсалес, Эмилио; Бург, Джон С; Ataie, Niloufar J; Лам, Эми Дж; Крэнфилл, Паула Дж (2014). «Неинвазивная прижизненная визуализация клеточной дифференцировки с ярким красным возбудимым флуоресцентным белком». Методы природы. 11 (5): 572–578. Дои:10.1038 / nmeth.2888. ЧВК 4008650. PMID 24633408.
  12. ^ Mo, Gary C.H .; Познер, Клара; Родригес, Эрик А .; Солнце, Тэнцянь; Чжан, Цзинь (декабрь 2020 г.). «Рационально усиленный красный флуоресцентный белок расширяет возможности биосенсоров FRET». Nature Communications. 11 (1): 1848. Bibcode:2020НатКо..11.1848M. Дои:10.1038 / с41467-020-15687-х. ISSN 2041-1723. ЧВК 7160135. PMID 32296061.
  13. ^ Сакауэ-Савано, Асако; Курокава, Хироши; Моримура, Тошифуми; Ханю, Аки; Хама, Хироши; Осава, Хацуки; Кашиваги, Саори; Фуками, Киёко; Мията, Такаки (2008-02-08). «Визуализация пространственно-временной динамики развития многоклеточного клеточного цикла». Клетка. 132 (3): 487–498. Дои:10.1016 / j.cell.2007.12.033. ISSN 1097-4172. PMID 18267078. S2CID 15704902.

внешняя ссылка