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EIN Chromatogramm ist eine visuelle Darstellung der getrennten Stoffe, die durch Chromatographie (eine Reihe von Labortechniken zur Trennung von Gemischen). Unterschiedliche Peaks oder Muster im Chromatogramm weisen auf das Vorhandensein unterschiedlicher Komponenten in der getrennten Mischung hin.

In der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (auch als Hoch-Druck Flüssigkeitschromatographie) und Gaschromatographie (GC) ist eine zweidimensionale Darstellung des Detektorsignals gegen die Zeit aufgetragen. Es entsteht ein Gipfel wenn die Substanz den Detektor passiert.

Biene Papierchromatographie (PC) und Dünnschichtchromatographie (DLC) die getrennten Substanzen gelten, wenn Flecken auf der DLC-Platte oder dem Papier auftreten.

Chromatogramm von a KieselalgePhaeodactylum tricornutum

Trennung

Ein Chromatogramm kann verwendet werden, um festzustellen, ob eine Trennung gut verlaufen ist. Je nach verwendeter Chromatographietechnik gibt es verschiedene Arten von Chromatogrammen. Bei der Papierchromatographie und Dünnschichtchromatographie wird die Trennung anhand von Flecken auf dem verwendeten Blatt oder der verwendeten Platte bestimmt. Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie wird die Trennung anhand von Peaks im Chromatogramm bestimmt.

Bereitstellung

Qualitative Bestimmung

Gaschromatographie oder Hochdruckchromatographie mit zugehörigen Retentionszeitberechnungen

Anhand eines Chromatogramms kann man unter anderem feststellen, welche Stoffe ein Gemisch enthält, wie komplex es ist Analyt und wie rein die Mischung ist. Beispielsweise kann analysiert werden, ob ein Gemisch den gewünschten Analyten enthält.

Der Analyt kann bestimmt werden, indem ein Chromatogramm von a Referenzsubstanz. Eine Referenzsubstanz ist eine Substanz, von deren Eigenschaften erwartet wird, dass sie dem verwendeten Analyten entsprechen.

Ein Chromatogramm von HPLC oder GC zeigt Peaks. Die Lage eines Peaks im Chromatogramm wird durch die Aufbewahrungszeit. Die Retentionszeit ist die Zeit vom Start der Messung bis zum Auftreten des Peaks des jeweiligen Analyten. Durch Berechnung der Retentionszeit einer Referenzsubstanz und Vergleich mit der Retentionszeit des Analyten kann festgestellt werden, ob der Analyt der Referenzsubstanz entspricht.

Ein Chromatogramm aus Dünnschichtchromatographie und Papierchromatographie zeigt Flecken. Diese sind ohne Hilfsmittel mit bloßem Auge nicht immer sichtbar. Um die Flecken sichtbar zu machen, kann man ultraviolettes Licht oder ein geeignetes Reagenz wie Kaliumpermanganat (KMnO₄) sprühen. Der Analyt kann bestimmt werden, indem man die Spots der Referenzsubstanz mit den Spots des zu analysierenden Gemisches auf der DC-Platte vergleicht. Anhand der Höhe der Spots auf der DC-Platte kann festgestellt werden, ob die Mischung den entsprechenden Analyten enthält.

Quantitative Bestimmung

Bei Techniken in der Chromatographie, bei denen die Messungen zu Peaks führen, entspricht die Konzentration des Analyten der Fläche unter dem Peak des Analyten. Eine andere Möglichkeit, die Konzentration des Analyten zu bestimmen, besteht darin, eine Kalibrierungskurve zu erstellen. Dies geschieht durch Auflösen des reinen Analyten in einem geeigneten Lösungsmittel und anschließender Verdünnungsreihe. Von den verschiedenen Verdünnungen wird ein Chromatogramm erstellt und die Konzentration der Lösung gegen das Detektorsignal grafisch aufgetragen, dies ist die sogenannte Kalibrierkurve. Das aus dem Chromatogramm gewonnene Detektorsignal des zu bestimmenden Analyten kann in die Kalibrierlinie gelegt und abgelesen werden.

Bestimmung der Säuleneffizienz

Bei Techniken in der Chromatographie, bei denen die Messungen zu Peaks führen, können die Peaks verwendet werden, um andere Bestimmungen durchzuführen.

Es Untertassennummer ist ein Maß für die Effizienz einer Chromatographiesäule, die von der Qualität und Länge der Säule abhängt. Je größer diese Zahl ist, desto größer ist die Effizienz einer Säule. Die Tellernummer kann mit der Formel berechnet werden^[1]:

${displaystyle N=5.54cdot ({{t_{r}} über {w_{1/2}}})^{2}}$

Bei welchem:

• ${displaystyle t_{r}}$ die Aufbewahrungszeit
• ${displaystyle w_{1/2}}$ die Breite des Peaks bei 50% der Peakhöhe

Oft die Schüsselhöhe kann auch verwendet werden, um die Effizienz einer Säule zu ermitteln. Die Schüsselhöhe kann mit der Formel berechnet werden^[2]:

${displaystyle H={L über N}}$

Bei welchem:

• ${Anzeigestil L}$ die Länge der Spalte
• ${Displaystil N}$ die Untertassennummer

Bestimmung des Retentions-/Kapazitätsfaktors

Bei Trennmethoden, die Säulen verwenden, ist der Kapazitätsfaktor ein Ausdruck der Leistung der Säule. Dies gilt für Chromatographietechniken wie GC oder HPLC. Der Kapazitätsfaktor hängt nicht von der Fließrate oder der Säulenlänge, sondern von den experimentellen Bedingungen. Der Retentionsfaktor ist ein Maß für die Zeit, in der sich eine Substanz in der stationären Phase befindet, relativ zur Zeit, in der sich eine Substanz in der mobilen Phase befindet. Der Kapazitätsfaktor kann wie folgt berechnet werden^[3]:

${displaystyle k'={{{t_{r}}-{t_{0}}} über {t_{0}}}}$

Bei welchem:

• ${displaystyle t_{r}}$ die Aufbewahrungszeit
• ${displaystyle t_{0}}$ die tote zeit

Papierchromatogramm

In der Chromatographie, bei der die Trennungen zu Flecken auf einer Platte oder einem Blatt führen, wie TLC und Papierchromatographie, wird dies als Retentionsfaktor. Dies ist ein Maß für die Affinität des Analyten für das Blutplättchen. Der Retentionsfaktor kann mit der Formel berechnet werden^[4]:

${displaystyle {R_{f}}={{Migrationsanalyt} über {loopfront}}}$

Das ${displaystyle {R_{f}}}$ Wert sollte zwischen 0 und 1 . liegen^[5]. Je geringer die Affinität des Analyten zum Thrombozyten ist, desto weiter liegt der Analytspot auf der Platte und desto größer ist der Retentionsfaktor und umgekehrt.

Bestimmungsauflösung

Beispieltrennung zweier Substanzen in GC oder HPLC

Das Auflösung ist ein Maß für die Trennung zweier Substanzen in der Chromatographie während der Messzeit eines Experiments. Die Trennung hängt von den Versuchsbedingungen und der Affinität der Substanzen zur stationären Phase ab, diese ist für jede Substanz unterschiedlich. Liegen mehrere Stoffe in einer Lösung vor, so bindet die Substanz mit der höheren Affinität zur stationären Phase stärker an die stationäre Phase und erleidet damit eine stärkere Verzögerung als die Substanz mit geringerer Affinität. Die Auflösung lässt sich wie folgt berechnen:

${displaystyle R={({0.589cdot Delta {t_{r}}}) über {w_{1/2av}}}}$

Bei welchem:

• ${displaystyle Delta {t_{r}}}$ die Differenz zwischen den Retentionszeiten zweier Peaks
• ${displaystyle {w_{1/2av}}}$ die durchschnittliche Peakhöhe bei halber Peakbreite der beiden Peaks

Für eine quantitative Bestimmung ist eine Auflösung von R > 1,5 erforderlich^[6]. Mit diesem Wert liegen die Peaks komplett auseinander und die Fläche beider Graphen kann bestimmt werden. Aus den Flächen der Peaks lässt sich das Verhältnis zweier Stoffe in einer Lösung bestimmen.

Der ideale Gipfel

Der ideale Peak hat die Form von a Gauss-Kurve. Die Gauss-Kurve liefert sowohl die Beziehung zwischen der Peakbreite und dem Standardabweichung wenn es Verteilungskoeffizient Auf. Die Beziehung zwischen der Peakbreite und der Standardabweichung kann durch die folgenden Formeln angegeben werden^[7]:

${displaystyle {w_{1/2}} = 2,35 cdot sigma }$

${displaystyle w={4cdot sigma }}$

${displaystyle {0.589cdot w}={w_{1/2}}}$

Bei welchem:

• ${Anzeigestil w}$ die Breite der Spitze
• ${displaystyle {w_{1/2}}}$ die Breite des Peaks bei 50% der Peakhöhe
• ${Displaystil-Sigma}$ die Standardabweichung

Der Verteilungskoeffizient ist in diesem Fall gleich dem Verhältnis der Stoffe in der mobilen und stationären Phase und lässt sich wie folgt berechnen^[8]:

${displaystyle K={frac {C_{s}}{C_{m}}}}$

Bei welchem:

• ${displaystyle {C_{s}}}$ die Konzentration des Analyten in der stationären Phase
• ${displaystyle {C_{m}}}$ die Konzentration des Analyten in der mobilen Phase

Wenn das Verhältnis dieser beiden Konzentrationen 1:1 beträgt, haben wir eine ideale Kurve, die Gauss-Kurve.

Abweichungen

vorderseite

Tailing

Die Peaks aus den Chromatogrammen von GC und HPLC sind oft nicht ideal wie die Gauss-Kurve. Es kann also vorderseite und Besatz Performance. Fronting wird durch eine überladene Probe oder durch eine zu hohe Flussrate verursacht, die die Probe daran hindert, die mobile und stationäre Phase auszugleichen. Tailing beinhaltet eine Peakverbreiterung am Ende der Kurve. Dies wird durch das Alter der Säulen verursacht, was die Auflösung verringert. Ein Maß für die Asymmetrie eines Peaks wird als Symmetriefaktor. Der Symmetriefaktor wird zu 10 % der Peakhöhe nach folgender Formel berechnet^[9]:

${displaystyle a={B über A}}$

Bei welchem:

• ${Anzeigestil A}$ Entfernung vom Anfang des Gipfels bis zur Mitte des Gipfels
• ${Anzeigestil B}$ Abstand von der Mitte des Gipfels bis zum Ende des Gipfels

Der Tailing-Faktor wird zu 5% der Peakhöhe mit der folgenden Formel berechnet calculated^[9]:

${displaystyle T={{(A B)} über {2A}}}$

Ein Wert von T = 1 bedeutet, dass der Peak symmetrisch ist^[6].

Verweise

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