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High-performance liquid chromatography
Säule in einem HPLC-Aufbau

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC; manchmal auch Hochdruckflüssigkeitschromatographie genannt) ist eine Methode der Trennung; es ist Flüssigkeits-Chromatographie bei dem die Eluent unter hohem Druck durch ein hoch gepacktes Säule wird gepumpt.

Der Druck kann bei normaler HPLC bis auf etwa 200 ansteigen Bar. Vor dem UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) kann der Druck bis zu 1000 bar oder mehr betragen. Durch den hohen Druck und den guten Kontakt zur stationären Phase wird eine relativ hohe Trenngeschwindigkeit und ein sehr gutes Auflösung. Eine typische Laufzeit für die Messung einer Probe durch HPLC liegt zwischen 5 und 60 Minuten.

Prinzip

Die Probe wird mit a . injiziert Injektor. Dieser Injektor ist eine Art Wasserhahn mit a gehen dazu eine Schleife mit einem genau bekannten Volumen (normalerweise 5l-5ml). Dieser Zylinder wird mit einer Spritze gefüllt, danach wird die Position des Hahns so gedreht, dass die Stichprobe wird in das System eingespritzt. Danach bewegt sich die Probe zusammen mit der mobilen Phase durch die Säule. Aufgrund der relativ hohen Geschwindigkeit der mobilen Phase findet kaum eine Diffusion der Probe im Lösungsmittel statt.

Die Geschwindigkeit, mit der die Komponenten der Probe die Säule passieren, kann durch Zugabe eines Modifikators beeinflusst werden, der die Elution in die mobile Phase beschleunigt. Der prozentuale Modifikator kann während der gesamten Analyse gleich bleiben (isokratische Chromatographie) oder während der Analyse ansteigen (Gradient).

Der verwendete Modifikator hängt von der Art der Chromatographie ab.

Art der ChromatographieHäufig verwendete basische EluentenHäufig verwendete Modifikatoren
UmkehrphasenchromatographieWasser, ggf. mit Puffersalzen und/oder anderen ZusätzenMethanol, Acetonitril
NormalphasenchromatographieHexan (oder ähnliche Alkane), Methanol, AcetonitrilWasser, Methanol, Acetonitril
IonenaustauschchromatographieLösungen von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat und anderen Salzen andereLösungen von Natriumacetat, Natriumhydrogencarbonat und anderen Salzen

Weitere wichtige Faktoren bei der Trennung sind: Zusammensetzung des Eluenten (pH, Zugabe von Additiven), Kolonnentyp, Durchflussmenge (Flow), Länge der Rohre.

Trennmethoden

Das Innere der Säule, die stationäre Phase, ist mit einer Packung kleiner Kugeln gefüllt. Diese Dichtung besteht normalerweise aus Siliziumdioxid, aber auch andere Materialien werden gefunden. Die Größe der Kugeln hängt vom Säulentyp ab, am häufigsten werden jedoch Durchmesser zwischen 3 m und 5 m verwendet. Kleinere Partikel ergeben eine bessere Trennung als größere Partikel, aber auch einen höheren Druck. Dies hat zur Folge, dass bei einer Säule mit großen Partikeln mehr Spielraum zur Variation des Flusses besteht. Die Kugeln sind mit einer aktiven Schicht "beschichtet" (chemisch gebunden), die mit dem Mobile Phase und die Bestandteile der zu analysierenden Probe.

Normalphasenchromatographie

Bei der Normalphasen-HPLC ist die Packung der Säule polar und die mobile Phase unpolar. Dadurch wechselwirken polare Komponenten stärker mit der stationären Phase als unpolare Komponenten. Somit verlassen unpolare Komponenten die Säule schneller als polare Komponenten. Aufgrund des hohen Verbrauchs an organischen Lösungsmitteln wird die Normal Phase HPLC noch selten eingesetzt, für die meisten Anwendungen gibt es eine umweltfreundlichere Reversed Phase Alternative.

Hydrophile-Interaktions-Flüssigkeitschromatographie (HILIC)

HILIC ist eine Variante der Normalphasen-HPLC. NPLC verwendet ein apolares Lösungsmittel als mobile Phase. Dies bringt das Problem mit sich, dass manche Stoffe so hydrophil sind, dass sie sich nicht mehr von der Säule lösen können. Durch Zugabe von weniger als 20 % Wasser zum Eluenten kann jedoch sichergestellt werden, dass auch diese Stoffe aus der Säule entfernt werden. Durch die Konkurrenz des Wassers und der Stoffe um die Bindung an die Säule werden schließlich alle Stoffe durch das Wasser aus der Säule ausgestoßen und verlassen so die Säule in der Reihenfolge zunehmender Polarität. Die Wasserzugabe kann isokratisch oder mit einem Gradienten erfolgen.

Umkehrphasenchromatographie

Bei der Umkehrphasen-HPLC wird die Polarität gegenüber der Normalphasen-HPLC umgekehrt; die Packung der Säule ist unpolar und die mobile Phase ist polar. Dadurch ist auch die Elutionsreihenfolge der verschiedenen Komponenten im Vergleich zur Normalphasen-HPLC umgekehrt: Polare Komponenten verlassen die Säule schneller als unpolare Komponenten.

Paar-Ionen-Chromatographie

Diese Technik wird verwendet, um mit einer Reversed-Phase-Säule hochpolare Substanzen aufzutrennen, die normalerweise gar nicht an die stationäre Phase der Säule binden würden, da diese unpolar ist. Dadurch findet keine Trennung statt, da sie alle mit der gleichen Geschwindigkeit von der Säule kommen. Wenn der pH-Wert der mobilen Phase nicht ausreicht, um die Polarität der Substanzen zu verringern, kann der mobilen Phase ein Ionenpaarungsreagenz zugesetzt werden.

Ein Ionenpaarungsreagenz ist eine Substanz, die aus einer Kohlenstoffkette und einer funktionellen Gruppe besteht, deren Ladung der des zu trennenden Analyten entgegengesetzt ist. Der Analyt und das Ionenpaarungsreagenz bilden ein "neutralisiertes" Ionenpaar, das weniger polar und ziemlich stabil ist. Da dieses Ionenpaar weniger polar ist, bleibt es an der stationären Phase hängen und kann daher getrennt werden.

Hydrophobe-Interaktions-Chromatographie (HIC)

Diese Methode ist eine Variante der Reversed Phase HPLC und wird häufig zur Trennung von Proteinen verwendet. Für einen guten Nachweis der verschiedenen Proteine ​​ist es notwendig, dass sie in wässriger Lösung verbleiben und nicht mit Lösungsmitteln oder Oberflächen in Kontakt kommen, die sie denaturieren können. Durch die Bildung eines Salzgradienten mit hohen Salzgehalten am Anfang wird das Gleichgewicht der Proteine ​​zwischen mobiler Phase und stationärer Phase in Richtung stationärer Phase getrieben. Durch langsames Absenken des Salzgehalts lösen sich die Proteine ​​wieder von der Säule.

Ionenaustauschchromatographie (IEC)

Vorstehend haben wir gesehen, dass die Trennung mittels HPLC üblicherweise auf der Grundlage der Polarität erfolgt, wobei polare Substanzen eine hohe Affinität zueinander aufweisen, nicht jedoch für unpolare Substanzen. Bei der Ionenchromatographie auf Basis elektrischer Ladung ist dies genau umgekehrt. Positive Ladung stößt positive Ladung ab und zieht negative Ladung an. Die stationären Phasen in IEC sind gekennzeichnet durch die Stärke der sauren oder basischen Gruppen und die Art der Ionen, die sie binden.

Kationenaustausch wird verwendet, um positiv geladene Ionen (Kationen) an eine negative Oberfläche zu binden und Anionenaustausch, um negativ geladene Ionen (Anionen) an eine positive Oberfläche zu binden. Starke Ionenaustauscher werden verwendet, um schwache Säuren oder Basen abzutrennen, die ihre Ladung in einem weiten pH-Bereich halten. Die schwachen Säuren oder Basen werden so in ionisierter Form auf die Säule aufgebracht und können so an die stationäre Phase binden. Anschließend wird der pH-Wert der mobilen Phase so eingestellt, dass die Substanz neutral wird. Die stationäre Phase bleibt jedoch geladen, da sie stark saure oder basische Gruppen aufweist. Dadurch verschwindet die Affinität zwischen der Substanz und der stationären Phase und diese Substanz kommt von der Säule.

Bei der Trennung starker Säuren oder Basen wird das Prinzip genau umgekehrt und eine stationäre Phase mit schwach sauren oder basischen Gruppen verwendet. Dadurch wird die stationäre Phase bei einer pH-Änderung neutral und die Affinität zwischen Substanz und stationärer Phase verschwindet wieder, so dass sie sich von der Säule löst.

Chirale Chromatographie

Wenn die Strukturformel des Analyten a asymmetrisches Kohlenstoffatom enthält dies bedeutet in der Regel, dass der Stoff in einer Mischung aus R und S . vorliegt EnantiomereDiese Mischung ist von einer normalen Säule nicht zu unterscheiden, da sie gleichermaßen an die stationäre Phase binden. Die beiden Substanzen verlassen dann gleichzeitig die Säule und geben am Detektor nur einen Peak ab. Dies ist mit einer chiralen Säule möglich, bei der die stationäre Phase auch aus Enantiomeren besteht. Die Trennung wird durch die reversiblen Bindungen von R (Analyt) / R (stationäre Phase und S (Analyt) / S (stationäre Phase) verursacht, deren Stabilität leicht unterschiedlich ist. Der Stabilitätsunterschied der Bindung führt zu einer Trennung und dass schließlich zwei Spitzen entstehen.

Erkennungsmethoden

sehen Detektor (Chromatographie) für den Hauptartikel zu diesem Thema.

Das Chromatographie ist wichtig, um die Zusammensetzung der Probe zu bestimmen, aber um die Konzentration der Probe zu bestimmen, gibt es eine gewisse Detektor erforderlich. Für HPLC gibt es mehrere Detektoren. Einige häufig verwendete sind die folgenden:

Spalteneigenschaften

EigentumEinfluss auf die Scheidung
SäulendurchmesserSäulen mit kleinem Durchmesser ergeben schmalere und höhere Peaks als Säulen mit großem Durchmesser. Dadurch ist die Nachweisgrenze niedriger. Säulen mit kleinem Durchmesser sind für Proben geeignet, in denen die Analytkonzentration niedrig ist. Bei hoher Konzentration des Analyten ist es besser, eine Säule mit großem Durchmesser zu verwenden, da es sonst zu einer Überladung der Säule kommen kann.
SäulenlängeEine lange Säule ergibt eine bessere Trennung als eine kurze Säule. Daher eignen sich lange Säulen für Proben mit vielen verschiedenen Komponenten oder wenn zwei Komponenten mit geringem Polaritätsunterschied getrennt werden müssen.
PartikelgrößeEine Säule mit kleinen Partikeln ergibt eine bessere Trennung, aber auch einen höheren Druck und ist daher nicht für hohe Durchflüsse geeignet. Große Partikelsäulen eignen sich besonders dann, wenn Schnelligkeit wichtiger ist als eine gute Trennung und für die präparative Chromatographie.
DichtungsmaterialEine C18-Säule ist weniger polar als eine C8-Säule und hat daher mehr Wechselwirkung mit unpolaren Molekülen. C8- und C4-Säulen eignen sich für polare Proben wie beispielsweise Peptide.

Quantifizierung

Je höher die Konzentration der injizierten Verbindung ist, desto größer ist das vom Detektor gelieferte Signal. Das Signal hat die Form eines Peaks (in a Diagramm) und die gemessene Peakfläche wird zur Quantifizierung von Konzentrationen verwendet.Durch unterschiedliche Konzentrationen von a Standard injizieren kann a . sein Kalibrierlinie gebaut werden. In einer Kalibrierkurve werden daher die Peakflächen gegen die bekannten zugehörigen Konzentrationen aufgetragen. Wenn die Peakfläche derselben Verbindung mit einer unbekannten Konzentration bestimmt wird, wird dieser Wert zu interpoliert in der Kalibrierkurve und damit die Konzentration bestimmt. Die gefundenen Konzentrationen müssen noch in umgerechnet werden Volumen- oder Gewichtseinheiten. Für diese Konvertierung verschiedene Methoden entwickelt.

Autosampler

Ein Autosampler ist ein Roboter Injektion der Proben auf die HPLC-Säule. Autosampler-Injektionen sind genauer und reproduzierbarer als manuelle Injektionen, und außerdem ermöglicht ein Autosampler die Messung mehrerer Proben nacheinander ohne menschliches Eingreifen. Ein Autosampler kann mit der Elektronik der HPLC selbst oder mit einem Chromatographie-Datensystem.

Verweise

  • Rouessac, F. und A., Chemical Analysis, Second Edition, John Wiley and Sons, Ltd – University of Le Mans, Frankreich 2007, Erstdruck, S. 80-86, ISBN 978-0-470-85902-5
  • Scott R.P.W., 2008, Fluoreszenzdetektor, eingesehen am 17.06.2010