WikiDer > Колоночная хроматография
Колоночная хроматография в химия это хроматография метод, используемый для выделения одного химическое соединение из смеси. Хроматография способна разделять вещества на основе дифференциальной адсорбции соединений на адсорбенте; соединения перемещаются по колонке с разной скоростью, что позволяет разделить их на фракции. Этот метод широко применим, поскольку можно использовать множество различных адсорбентов (нормальная фаза, обращенная фаза или другие) с широким диапазоном растворителей. Методика может применяться на весах от микрограммов до килограммов. Основным преимуществом колоночной хроматографии является относительно низкая стоимость и возможность одноразового использования. стационарная фаза используется в процессе. Последний предотвращает перекрестное загрязнение и деградацию стационарной фазы из-за повторного использования. Колоночная хроматография может быть проведена под действием силы тяжести для перемещения растворителя или с использованием сжатого газа для проталкивания растворителя через колонку.
А тонкослойный хроматограф может показать, как смесь соединений будет вести себя при очистке с помощью колоночной хроматографии. Разделение сначала оптимизируется с помощью тонкослойной хроматографии перед проведением колоночной хроматографии.
Подготовка колонки
Колонку готовят, набивая твердый абсорбент в цилиндрическую стеклянную или пластиковую трубку. Размер будет зависеть от количества выделяемого соединения. В основании пробирки находится фильтр, либо пробка из ваты, либо стекловата, либо стеклянная фритта для удержания твердой фазы на месте. Резервуар для растворителя может быть прикреплен к верхней части колонки.
Обычно для подготовки колонки используются два метода: сухой и влажный. Для сухого метода колонку сначала заполняют сухим порошком неподвижной фазы, а затем добавляют подвижную фазу, которая промывается через колонку до тех пор, пока она полностью не станет влажной, и с этого момента никогда не разрешается работать всухую.[1] Для мокрого метода суспензия подготовлен из элюент порошком неподвижной фазы, а затем осторожно вылили в колонку. Верх диоксида кремния должен быть плоским, а верх диоксида кремния можно защитить слоем песка. Элюент медленно пропускают через колонку для продвижения органического материала.
Отдельные компоненты удерживаются неподвижной фазой по-разному и отдельно друг от друга, пока они проходят с разной скоростью через колонку с элюентом. В конце колонки они элюируются по одному. В течение всего процесса хроматографии элюент собирают сериями фракции. Фракции могут собираться автоматически с помощью сборщиков фракций. Производительность хроматографии может быть увеличена за счет одновременного использования нескольких колонок. В этом случае используются многопоточные коллекторы. Можно контролировать состав потока элюента, и каждую фракцию анализировать на растворенные соединения, например аналитической хроматографией, УФ-спектры поглощения, или же флуоресценция. Цветные соединения (или флуоресцентные соединения с помощью УФ-лампы) можно увидеть сквозь стеклянную стену как движущиеся полосы.
Стационарная фаза
В стационарная фаза или же адсорбент в колоночной хроматографии - твердое вещество. Наиболее распространенная стационарная фаза для колоночной хроматографии - это силикагель, следующее по распространенности существо глинозем. Целлюлоза порошок часто использовался в прошлом. Доступен широкий спектр стационарных фаз для выполнения ионообменная хроматография, обращенно-фазовая хроматография (RP), аффинная хроматография или же адсорбция в расширенном слое (EBA). В стационарные фазы обычно представляют собой тонко измельченные порошки или гели и / или микропористые для увеличенной поверхности, хотя в EBA используется псевдоожиженный слой. Существует важное соотношение между массой неподвижной фазы и сухой массой смеси аналитов, которую можно наносить на колонку. Для колоночной хроматографии на диоксиде кремния это соотношение находится в пределах от 20: 1 до 100: 1, в зависимости от того, насколько близко друг к другу элюируются компоненты анализируемого вещества.[2]
Подвижная фаза (элюент)
В Мобильная фаза или же элюент это растворитель или смесь растворителей, используемых для перемещения соединений через колонку. Он выбран так, чтобы коэффициент удержания Значение интересующего соединения составляет примерно 0,2-0,3, чтобы минимизировать время и количество элюента для проведения хроматографии. Элюент также был выбран так, чтобы можно было эффективно разделять различные соединения. Элюент оптимизируют в небольших предварительных испытаниях, часто с использованием тонкослойная хроматография (ТСХ) с той же стационарной фазой.
Оптимальный скорость потока для каждого отдельного разделения. Более высокая скорость потока элюента сводит к минимуму время, необходимое для работы колонки, и тем самым минимизирует диффузию, что приводит к лучшему разделению. Однако максимальная скорость потока ограничена, поскольку аналиту требуется конечное время для достижения равновесия между неподвижной фазой и подвижной фазой, см. Уравнение Ван Демтера. Простая лабораторная колонка проходит по сила тяжести поток. Скорость потока такой колонны может быть увеличена за счет расширения колонки, заполненной свежим элюентом, над верхом неподвижной фазы или уменьшена с помощью регулятора давления. Более высокая скорость потока может быть достигнута с помощью насоса или сжатого газа (например, воздуха, азот, или же аргон), чтобы пропустить растворитель через колонку (колоночная флэш-хроматография).[3][4]
Размер частиц неподвижной фазы при флэш-хроматографии на колонке обычно меньше, чем при колоночной гравитационной хроматографии. Например, одна из наиболее широко используемых марок силикагеля в первом методе - это силикагель с ячейками 230–400 (40–63 мкм), тогда как во втором методе обычно требуется силикагель с ячейками 70–230 (63–200 мкм).[5]
Была разработана электронная таблица, которая помогает в успешной разработке столбцов Flash. В электронной таблице оцениваются удерживаемый объем и объем полосы аналитов, числа фракций, которые, как ожидается, будут содержать каждый аналит, и разрешение между соседними пиками. Эта информация позволяет пользователям выбирать оптимальные параметры для препаративного разделения до того, как будет предпринята попытка использования флэш-колонки.[6]
Автоматизированные системы
Колоночная хроматография - чрезвычайно трудоемкий этап в любой лаборатории и может быстро стать узким местом для любой производственной лаборатории. Многие производители, такие как Biotage, Buchi, Interchim и Teledyne Isco, разработали системы автоматической флэш-хроматографии (обычно называемые LPLC, жидкостной хроматографией низкого давления, около 350–525 кПа или 50,8–76,1 фунт / кв. Дюйм), которые сводят к минимуму участие человека в процессе очистки. Автоматизированные системы будут включать компоненты, которые обычно можно найти на более дорогих высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) системы, такие как градиентный насос, отверстия для ввода пробы, УФ-детектор и коллектор фракций для сбора элюента. Как правило, эти автоматизированные системы могут разделять образцы от нескольких миллиграммов до многих килограммов в промышленных масштабах и предлагают гораздо более дешевое и быстрое решение для выполнения множественных инъекций в системах препаративной ВЭЖХ.
Разрешение (или способность разделять смесь) в системе LPLC всегда будет ниже по сравнению с HPLC, так как насадочный материал в колонке HPLC может быть намного меньше, обычно всего 5 микрометров, что увеличивает площадь поверхности неподвижной фазы, увеличивая взаимодействие поверхностей и дает лучшее разделение. Однако использование этой небольшой насадочной среды вызывает высокое противодавление, поэтому ее называют жидкостной хроматографией высокого давления. Колонны LPLC обычно заполнены диоксидом кремния размером около 50 микрометров, что снижает противодавление и разрешение, но также устраняет необходимость в дорогостоящих насосах высокого давления. В настоящее время производители начинают переходить на системы флэш-хроматографии при высоком давлении и называют их системами жидкостной хроматографии среднего давления (MPLC), которые работают при давлении выше 1 МПа (150 фунтов на кв. Дюйм).
Расчет разрешения колоночной хроматограммы
Обычно для колоночной хроматографии используются перистальтические насосы, проточные буферы и образец раствора через верх колонки. Растворы и буферы проходят через колонку, где коллектор фракций в конце колонки собирает элюированные образцы. Перед сбором фракций образцы, элюированные из колонки, проходят через детектор, такой как спектрофотометр или же масс-спектрометр так что можно определить концентрацию разделенных образцов в смеси образцов раствора.
Например, если вы должны отделить два разных белка с разной способностью связывания с колонкой от образца раствора, хорошим типом детектора будет спектрофотометр, использующий длину волны 280 нм. Чем выше концентрация белка, который проходит через элюированный раствор через колонку, тем выше поглощение на этой длине волны.
Поскольку колоночная хроматография имеет постоянный поток элюированного раствора, проходящего через детектор при различных концентрациях, детектор должен отображать концентрацию элюированного образца с течением времени. Этот график зависимости концентрации образца от времени называется хроматограммой.
Конечная цель хроматографии - отделить различные компоненты от смеси растворов. Разрешение выражает степень разделения компонентов смеси. Чем выше разрешение хроматограммы, тем лучше степень разделения образцов, которую дает колонка. Эти данные - хороший способ определить разделительные свойства колонки этого конкретного образца. Разрешение можно рассчитать по хроматограмме.
Отдельные кривые на диаграмме представляют различные профили концентрации элюируемых образцов во времени в зависимости от их сродства к смоле колонки. Для расчета разрешения требуются время удерживания и ширина кривой.
Время удерживания - это время от начала обнаружения сигнала детектором до высоты пика профиля концентрации элюирования каждого отдельного образца.
Ширина кривой - это ширина кривой профиля концентрации различных образцов на хроматограмме в единицах времени.
Упрощенный метод расчета разрешения хроматограммы заключается в использовании модели пластины.[7] Модель тарелки предполагает, что колонна может быть разделена на определенное количество секций или тарелок, и баланс массы может быть рассчитан для каждой отдельной тарелки. Этот подход аппроксимирует типичную кривую хроматограммы как Гауссово распределение изгиб. При этом ширина кривой оценивается как 4-кратное стандартное отклонение кривой, 4σ. Время удерживания - это время от начала обнаружения сигнала до момента пика гауссовой кривой.
Из переменных, представленных на рисунке выше, можно рассчитать разрешение, номер тарелки и высоту тарелки модели колонны-тарелки с помощью формул:
Разрешение (Rs)
рs = 2 (tРБ - тРА) / (wB + wА)
Где:
тРБ = время удерживания растворенного вещества B
тРА = время удерживания растворенного вещества A
шB = Ширина гауссовой кривой растворенного вещества B
шА = Ширина гауссовой кривой растворенного вещества A
Табличный номер (N):
N = (tр)2/ (с 4)2
Высота плиты (H):
H = L / N
Где L - длина столбца.[7]
Равновесие адсорбции на колонке
Для адсорбционной колонки смола колонки (неподвижная фаза) состоит из микрошариков. Даже более мелкие частицы, такие как белки, углеводы, ионы металлов или другие химические соединения, конъюгированы с микрогранулами. Можно предположить, что каждая связывающая частица, прикрепленная к микрогранулам, связывается в соотношении 1: 1 с пробой растворенного вещества, отправляемой через колонку, которую необходимо очистить или отделить.
Связывание между разделяемой целевой молекулой и связывающей молекулой на шариках колонки можно смоделировать с помощью простой равновесной реакции Kэкв = [CS] / ([C] [S]) где Kэкв это константа равновесия, [C] и [S] - концентрации целевой молекулы и связывающей молекулы на смоле колонки соответственно. [CS] - это концентрация комплекса целевой молекулы, связанной со смолой колонки.[7]
Используя это в качестве основы, можно использовать три разные изотермы для описания динамики связывания колоночной хроматографии: линейная, Ленгмюровская и Фрейндлих.
Линейная изотерма возникает, когда концентрация растворенного вещества, необходимая для очистки, очень мала по сравнению с связывающей молекулой. Таким образом, равновесие можно определить как:
[CS] = Kэкв[C].
Для использования в промышленном масштабе необходимо учитывать общее количество связывающих молекул на шариках смолы колонки, потому что необходимо учитывать незанятые участки. В Изотерма Ленгмюра и изотерма Фрейндлиха полезны для описания этого равновесия. Изотерма Ленгмюра:
[CS] = (KэквSмалыш[C]) / (1 + Kэкв[C]), где Sмалыш общее количество связывающих молекул на гранулах.
Изотерма Фрейндлиха:
[CS] = Kэкв[C]1 / п
Изотерма Фрейндлиха используется, когда колонка может связываться со многими различными образцами в растворе, который необходимо очистить. Поскольку множество разных образцов имеют разные константы связывания с шариками, существует много разных Keq. Следовательно, изотерма Ленгмюра не является хорошей моделью для связывания в этом случае.[7]
Смотрите также
- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) для колоночной хроматографии с использованием высокого давления.
- Быстрая жидкостная хроматография белков (FPLC) для разделения белков с помощью колоночной хроматографии.
Рекомендации
- ^ Шустерман, AJ; McDougal, PG; Гласфельд, А (1997). «Сухая колоночная флэш-хроматография». J Chem Educ. 74 (10): 1222. Bibcode:1997JChEd..74.1222S. Дои:10.1021 / ed074p1222. ISSN 0021-9584.
- ^ «Как настроить колонку с силикагелем для флэш-хроматографии и действительно добиться разделения». readdevices.com. REACH Devices, LLC. Получено 3 января 2019.
- ^ Тем не менее, туалет; Кан, М; Митра, А (1978). «Быстрая хроматографическая методика препаративного разделения с умеренным разрешением». J Org Chem. ACS. 43 (14): 2923–2925. Дои:10.1021 / jo00408a041.
- ^ Харвуд Л.М., Муди С.Дж. (13 июня 1989 г.). Экспериментальная органическая химия: принципы и практика (Иллюстрированный ред.). Лондон: Блэквелл. стр.180–185. ISBN 978-0-632-02017-1. OCLC 1079261960.
- ^ «Силикагель для сбора материала для колоночной хроматографии с нормальной фазой». Материальный урожай. 2008 г.. Получено 3 января 2019.
- ^ Ярмарка, JD; Кормос, CM (2008). «Флэш-хроматограммы на колонке, оцененные по данным тонкослойной хроматографии». J Хроматограф A. 1211 (1–2): 49–54. Дои:10.1016 / j.chroma.2008.09.085. ISSN 0021-9673. PMID 18849041.
- ^ а б c d Харрисон Р.Г., Тодд П.В., Радж С.Р., Петридес Д.П. (2003). Наука и техника биосепараций (2-е изд.). Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Oxford University Press. ISBN 9780190213732. OCLC 899240244.
