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Western blot
Ein Elektrophorese-Setup. Durch das Gel fließt ein Strom, wodurch die negativ geladenen Proteine ​​nach unten wandern.

EIN westlicher Fleck ist ein biochemisch Technik, mit der ein bestimmtes Protein in einer Mischung von Proteinen mittels Antikörper festgestellt werden kann. Im Allgemeinen sind die Proteine ​​in der Proteinmischung (zum Beispiel eine ZelleLysat) zunächst nach ihrer Größe getrennt bzw. Molekulargewicht durch ein SDB-SEITE (Gelelektrophorese). Dann werden die nach Größe getrennten Proteine ​​aus dem Gel auf a . "übertragen". Nitrozellulose- oder PVDFMembran, an der sie haften. Dieser Vorgang wird Blotting genannt. Der Western Blot wird in biochemischen und medizinische Untersuchung und in Diagnose. Der Western Blot gehört zur Gruppe der Immunblots.

Geschichte

Der Name des Färbeverfahrens („Western Blot“) leitet sich vom englischen Wort für Fleck und vom englischen Wort für Seidenpapier ab, was einen identischen Eindruck des Originals vermittelt. Western Blotting wurde als Namensspiel entwickelt, basierend auf dem sogenannten Southern Blot, einer ähnlichen Methode zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen. Edwin Süd gilt als Erfinder der Färbetechnik. 1975 entwickelte er eine Methode zur Trennung von DNA-Fragmenten und deren anschließender Hybridisierung. Südlicher Fleck namens. Die entsprechende Trennung von RNA-Fragmenten wurde Nordfleck nach seinem Namen benannt.[1] Daher wurde es Protein-Blotting mit SDS Western Blot genannt. Das Fernwestlicher Fleck wurde entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Als Kombination aus Western- und Southern-Blot ist die Südwestlicher Fleck zum Nachweis von DNA-Protein-Interaktionen entwickelt, ebenso wie der Northwestern Blot zum Nachweis von RNA-Protein-Interaktionen.

Operation

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

Im ersten Schritt wird die Proteinmischung Gelelektrophorese in einzelne Proteinbanden in einer Trägermatrix (SDB-SEITE, Native-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese), abhängig von Proteingröße, Ladung oder anderen Eigenschaften.[2]

Übertragung von Proteinen auf eine Membran

Die getrennten Proteinbanden werden dann vom Gel auf eine feste Trägermembran (Nitrocellulose, Nylon oder PVDF) für den Western Blot übertragen. Dieser Vorgang wird Blotting genannt. Dort werden sie mit Milch (oder anderen Blockern) blockiert, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern, und dann mit für das Zielprotein spezifischen Antikörpern gefärbt.[3]

Nachweis von Proteinen nach dem Blotting

Indirekt durch Antikörper

Das interessierende Protein kann mit einem proteinspezifischen Antikörper. Um diesen spezifisch gebundenen Antikörper sichtbar zu machen, wird der Blot nach Inkubation mit diesem ersten Antikörper mit einem zweiten Antikörper behandelt, der an den ersten Antikörper bindet. Dieser zweite Antikörper ist so markiert, dass man genau sehen kann, wo der erste Antikörper gebunden hat und sich somit das Protein befindet.

Western Blot, in dem Liponsäure-modifizierte Proteine ​​mit einem rot fluoreszierenden zweiten Antikörper sichtbar gemacht werden

Direkt mit Farbstoffen oder Autoradiographie

Nach dem Blotting kann die Membran auch mit spezifischen Farbstoffen wie Ponceau-S angefärbt werden, um alle übertragenen Proteine ​​sichtbar zu machen.

Mit Ponceau-S gefärbte Nitrozellulosemembran. Die blauen Banden links sind Markerproteine ​​zur Molekulargewichtsbestimmung

Sind die Proteine ​​selbstmarkiert, zum Beispiel mit radioaktivem Schwefel, können sie nach dem Blotting mit a . sichtbar gemacht werden Autoradiogramm.

Western Blot, in dem radioaktiv markierte Proteine ​​durch Autoradiographie sichtbar gemacht werden
Siehe die Kategorie Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Wikimedia Commons für Mediendateien zu diesem Thema.

Siehe auch

Verweise

  1. ↑Alwine J, Kemp D, Stark G (1977). Verfahren zum Nachweis spezifischer RNAs in Agarosegelen durch Übertragung auf Diazobenzyloxymethyl-Papier und Hybridisierung mit DNA-Sonden. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 (12): 5350–5354. PMID: 414220. PMC: 431715. DOI: 10.1073/pnas.74.12.5350.
  2. ↑https://www.antibodies-online.com/resources/17/1224/western-blotting-immunoblot-gel-electrophoresis-for-proteins/
  3. ↑Burnette WN (1981). Western Blotting: Elektrophoretischer Transfer von Proteinen aus Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen auf unmodifizierte Nitrocellulose und radiologische Detektion mit Antikörper und radioiodiertem Protein A Analytische Biochemie 112 (2): 195–203. ISSN:0003-2697. PMID: 6266278. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5.