WikiDer > Маркировка близости

Proximity labeling
Белки внешней мембраны митохондрий идентифицируются с помощью метки близости.

Ферментно-катализируемый маркировка близости (PL), также известный как маркировка на основе близости, это лабораторная техника это ярлыки биомолекулы, обычно белки или же РНК, проксимальнее интересующего белка.[1] Создавая слияние генов в живой клетке между представляющим интерес белком и сконструированным меченным ферментом биомолекулы, пространственно проксимальные к интересующему белку, затем могут быть выборочно помечены биотин за тянуть вниз и анализ. Маркировка близости использовалась для идентификации компонентов новых клеточных структур и для определения белок-белковое взаимодействие партнеров, среди других приложений.[2]

История

До разработки метки близости определение близости белков в клетках основывалось на изучении белок-белковых взаимодействий с помощью таких методов, как аффинная очистка-масс-спектрометрия и пробы лигирования близости.[3]

DamID это метод, разработанный в 2000 г. Стивен Хеникофф для идентификации частей генома, проксимальных к интересующему белку хроматина. DamID полагается на ДНК-метилтрансфераза слияние с белком хроматина с целью неестественного метилирования ДНК, которую затем можно секвенировать для выявления участков метилирования генома рядом с белком.[4] Исследователи руководствовались стратегией слияния белков DamID для создания метода сайт-специфической маркировки белков-мишеней, кульминацией чего стало создание BioID на основе биотиновых белков в 2012 году.[1] Алиса Тинг и лаборатория Тинга в Стэндфордский Университет разработали несколько белков, которые демонстрируют повышение эффективности и скорости бесконтактного мечения на основе биотина.[5][6][7][8]

Принципы

Маркировка близости основана на маркировке фермента, который может биотинилат соседние биомолекулы беспорядочно. Мечение биотина может быть достигнуто с помощью нескольких различных методов, в зависимости от вида фермента-метки.

  • BioID, также известный как BirA *, является мутантом Кишечная палочка биотинлигаза, которая катализирует активация биотина АТФ. Активированный биотин недолговечен и поэтому может диффундировать только к области, проксимальной к BioID. Маркировка достигается, когда активированный биотин вступает в реакцию с соседними амины, такой как лизин амины боковой цепи, обнаруженные в белках.[1] TurboID - это биотинлигаза, созданная с помощью дисплей поверхности дрожжей направленная эволюция. TurboID обеспечивает время маркировки ~ 10 минут вместо ~ 18 часов, требуемых BioID.[5]
  • APEX - это аскорбатпероксидаза производная, зависящая от пероксид водорода для катализирования окисления биотин-тирамида, также известного как биотин-фенол, до короткоживущего и реактивного биотин-фенола свободный радикал. Мечение достигается, когда это промежуточное соединение вступает в реакцию с различными функциональными группами близлежащих биомолекул. APEX также можно использовать для местного осаждения диаминобензидина, предшественника краситель для электронной микроскопии. APEX2 является производным от APEX, созданным путем эволюции, направленной на отображение поверхности дрожжей. APEX2 показывает улучшенную эффективность мечения и уровни клеточной экспрессии.[8]

Чтобы пометить белки, расположенные рядом с интересующим белком, типичный эксперимент по метке близости начинается клеточная экспрессия слияния APEX2 с интересующим белком, который локализуется в нативной среде интересующего белка. Затем клетки инкубируют с биотин-фенолом, затем кратковременно с перекисью водорода, инициируя образование свободных радикалов биотин-фенола и мечение. Чтобы свести к минимуму повреждение клеток, реакцию гасят с помощью антиоксидантного буфера. Клетки лизируются, и меченые белки удаляются с помощью стрептавидин бусы. Белки перевариваются трипсин, и, наконец, полученные пептидные фрагменты анализируют с помощью протеомика дробовика такие методы, как LC-MS / MS или SPS-MS3.[8]

Если вместо этого слияние белков генетически недоступно (например, в образцах тканей человека), но известно антитело к представляющему интерес белку, бесконтактное мечение все еще можно включить путем слияния фермента-метки с антителом, а затем инкубирования слияния с образцом .[9][10]

Приложения

Методы близкого мечения использовались для изучения протеомов биологических структур, которые иначе трудно выделить чисто и полностью, таких как реснички,[11] митохондрии,[6] постсинаптические расщелины,[2] р-тела, стрессовые гранулы,[12] и липидные капли.[13]

Слияние APEX2 с Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR) позволяет отслеживать передачу сигналов GPCR с временным разрешением 20 секунд.[14] а также идентификация неизвестных GPCR-связанных белков.[15]

Маркировка близости также использовалась для транскриптомика и интерактомика. В 2019 г. Алиса Тинг и лаборатория Ting использовали APEX для идентификации РНК, локализованной в определенных клеточных компартментах.[16][17] В 2019 году BioID был привязан к бета-актин транскрипт мРНК для изучения динамики его локализации.[18] Маркировка близости также использовалась для поиска партнеров по взаимодействию гетеродимерных протеинфосфатазыбелка miRISC (комплекс сайленсинга, индуцированный микроРНК) Назад2, и из рибонуклеопротеины.[3]

Последние достижения

Маркировка близости на основе TurboID использовалась для идентификации регуляторов рецептора, участвующего в врожденный иммунный ответ, а NOD-подобный рецептор.[19] Бесконтактное маркирование на основе BioID использовалось для определения молекулярного состава рак молочной железы клетка инвадоподии, которые важны для метастазирования.[20] Исследования близкого мечения на основе биотина демонстрируют повышенное мечение белков внутренне неупорядоченные области, предполагая, что метка близости на основе биотина может быть использована для изучения роли IDR.[21] А фотосенсибилизатор Нацеленная на ядро ​​малая молекула также была разработана для фотоактивируемого бесконтактного мечения.[22]

Рекомендации

  1. ^ а б c Ру, Кайл Дж .; Ким, Дэ Ин; Райда, Манфред; Берк, Брайан (19 марта 2012 г.). «Беспорядочный гибридный белок с биотин-лигазой идентифицирует проксимальные и взаимодействующие белки в клетках млекопитающих». Журнал клеточной биологии. 196 (6): 801–810. Дои:10.1083 / jcb.201112098. ISSN 0021-9525. ЧВК 3308701. PMID 22412018.
  2. ^ а б Хан, Шо; Ли, Цзефу; Тинг, Алиса Y (2018-06-01). «Маркировка близости: протеомное картирование с пространственным разрешением для нейробиологии». Текущее мнение в нейробиологии. Нейротехнологии. 50: 17–23. Дои:10.1016 / j.conb.2017.10.015. ISSN 0959-4388. ЧВК 6726430. PMID 29125959.
  3. ^ а б Тринкл-Малкахи, Лаура (31.01.2019). «Последние достижения в методах маркировки на основе близости для картирования интерактомов». F1000 Исследования. 8: 135. Дои:10.12688 / f1000research.16903.1. ISSN 2046-1402. ЧВК 6357996. PMID 30774936.
  4. ^ Стинзель, Бас ван; Хеникофф, Стивен (апрель 2000 г.). «Идентификация in vivo ДНК-мишеней белков хроматина с использованием привязанной метилтрансферазы Dam». Природа Биотехнологии. 18 (4): 424–428. Дои:10.1038/74487. ISSN 1546-1696.
  5. ^ а б Бранон, Тесс С .; Bosch, Justin A .; Санчес, Ариана Д .; Udeshi, Namrata D .; Свинкина, Таня; Карр, Стивен А .; Фельдман, Джессика Л .; Перримон, Норберт; Тинг, Алиса Ю. (2018-10-01). «Эффективное бесконтактное маркирование живых клеток и организмов с помощью TurboID». Природа Биотехнологии. 36 (9): 880–887. Дои:10.1038 / nbt.4201. ISSN 1546-1696. ЧВК 6126969. PMID 30125270.
  6. ^ а б Ри, Хён Ву; Цзоу, Пэн; Udeshi, Namrata D .; Мартелл, Джеффри Д .; Mootha, Vamsi K .; Карр, Стивен А .; Тинг, Алиса Ю. (2013-03-15). «Протеомное картирование митохондрий в живых клетках с помощью пространственно ограниченного ферментативного мечения». Наука. 339 (6125): 1328–1331. Bibcode:2013Научный ... 339.1328R. Дои:10.1126 / наука.1230593. ISSN 0036-8075. ЧВК 3916822. PMID 23371551.
  7. ^ Lam, Stephanie S .; Мартелл, Джеффри Д .; Kamer, Kimberli J .; Deerinck, Thomas J .; Эллисман, Марк Х .; Mootha, Vamsi K .; Тинг, Алиса Ю. (январь 2015 г.). «Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и бесконтактной маркировки». Природные методы. 12 (1): 51–54. Дои:10.1038 / nmeth.3179. HDL:1721.1/110613. ISSN 1548-7105.
  8. ^ а б c Калочей, Мариан (2019). «APEX-катализируемое пероксидазой метки близости и мультиплексная количественная протеомика». В Сунбуле, Мурат; Jäschke, Andres (ред.). Маркировка близости. Маркировка близости: методы и протоколы. Методы молекулярной биологии. 2008. Springer. С. 41–55. Дои:10.1007/978-1-4939-9537-0_4. ISBN 978-1-4939-9537-0. PMID 31124087.
  9. ^ Rees, Johanna S .; Ли, Сюэ-Вэнь; Перретт, Сара; Лилли, Кэтрин С .; Джексон, Энтони П. (2015-11-01). "Белковые соседи и протеомика близости". Молекулярная и клеточная протеомика. 14 (11): 2848–2856. Дои:10.1074 / mcp.R115.052902. ISSN 1535-9476. ЧВК 4638030. PMID 26355100.
  10. ^ Бар, Дэниел З; Аткатш, Кэтлин; Таварес, Уррака; Erdos, Michael R; Грюнбаум, Йосеф; Коллинз, Фрэнсис С. (февраль 2018 г.). «Биотинилирование путем распознавания антител - метод бесконтактного мечения». Методы природы. 15 (2): 127–133. Дои:10.1038 / nmeth.4533. ISSN 1548-7091. ЧВК 5790613. PMID 29256494.
  11. ^ Мик, Дэвид У .; Родригес, Рэйчел Б.; Лейб, Райан Д .; Адамс, Кристофер М .; Chien, Allis S .; Gygi, Стивен П .; Начуры, Максенс В. (2015-11-23). «Протеомика первичных ресничек по метке близости». Клетка развития. 35 (4): 497–512. Дои:10.1016 / j.devcel.2015.10.015. ISSN 1878-1551. ЧВК 4662609. PMID 26585297.
  12. ^ Юн, Джи Ён; Dunham, Wade H .; Хонг, Со Чжон; Найт, Джеймс Д.Р .; Башкуров Михаил; Чен, Джинни И .; Багчи, Халил; Ратод, Бхавиша; МакЛауд, Грэм; Eng, Simon W.M .; Анже, Стефан (февраль 2018 г.). «Картирование близости с высокой плотностью выявляет субклеточную организацию гранул и тел, связанных с мРНК». Молекулярная клетка. 69 (3): 517–532.e11. Дои:10.1016 / j.molcel.2017.12.020. ISSN 1097-2765. PMID 29395067.
  13. ^ Берсукер, Кирилл; Peterson, Clark W. H .; К, Милтон; Sahl, Steffen J .; Савихин Виктория; Гроссман, Элизабет А .; Nomura, Daniel K .; Ольцманн, Джеймс А. (2018-01-08). «Стратегия близкой маркировки дает представление о составе и динамике протеомов липидных капель». Клетка развития. 44 (1): 97–112.e7. Дои:10.1016 / j.devcel.2017.11.020. ISSN 1534-5807. PMID 29275994.
  14. ^ Пэк, Джэхо; Калочай, Мэриан; Staus, Dean P .; Винглер, Лаура; Пасколутти, Роберта; Пауло, Жоао А .; Gygi, Стивен П .; Круз, Эндрю К. (04 06, 2017). «Многомерное отслеживание передачи сигналов GPCR с помощью метки близости, катализируемой пероксидазой». Клетка. 169 (2): 338–349.e11. Дои:10.1016 / j.cell.2017.03.028. ISSN 1097-4172. ЧВК 5514552. PMID 28388415. Проверить значения даты в: | дата = (помощь)
  15. ^ Lobingier, Braden T .; Хюттенхайн, Рут; Эйхель, Келси; Миллер, Кеннет Б.; Тинг, Алиса Ю.; фон Застров, Марк; Кроган, Неван Дж. (04 06, 2017). «Подход к пространственно-временному разрешению сетей взаимодействия белков в живых клетках». Клетка. 169 (2): 350–360.e12. Дои:10.1016 / j.cell.2017.03.022. ISSN 1097-4172. ЧВК 5616215. PMID 28388416. Проверить значения даты в: | дата = (помощь)
  16. ^ Шилдс, Эмили Дж .; Петраковичи, Ана Ф .; Бонасио, Роберто (15.04.2019). «lncRedically универсальный: биохимические и биологические функции длинных некодирующих РНК». Биохимический журнал. 476 (7): 1083–1104. Дои:10.1042 / BCJ20180440. ISSN 0264-6021. ЧВК 6745715. PMID 30971458.
  17. ^ Fazal, Furqan M .; Хан, Шо; Паркер, Кевин Р .; Kaewsapsak, Pornchai; Сюй, Цзинь; Boettiger, Alistair N .; Chang, Howard Y .; Тинг, Алиса Ю. (11.07.2019). «Атлас субклеточной локализации РНК, выявленный APEX-Seq». Клетка. 178 (2): 473–490.e26. Дои:10.1016 / j.cell.2019.05.027. ISSN 0092-8674. PMID 31230715.
  18. ^ Мукерджи, Джойита; Гермеш, Орит; Элискович, Каролина; Налпас, Николас; Франц-Вахтель, Мирита; Мачек, Борис; Янсен, Ральф-Петер (25.06.2019). «Картирование взаимодействия мРНК β-актина посредством биотинилирования близости». Труды Национальной академии наук. 116 (26): 12863–12872. Дои:10.1073 / pnas.1820737116. ISSN 0027-8424. PMID 31189591.
  19. ^ Чжан, Юнлян; Сун, Гаоюань; Lal, Neeraj K .; Нагалакшми, Уграппа; Ли, Юаньюань; Чжэн, Вэньцзе; Хуанг, Пинь-цзюй; Бранон, Тесс С .; Тинг, Алиса Ю.; Уолли, Джастин У .; Динеш-Кумар, Савитрамма П. (19.07.2019). «Близкое мечение на основе TurboID показывает, что UBR7 является регулятором иммунитета, опосредованного иммунным рецептором N NLR». Nature Communications. 10 (1): 1–17. Дои:10.1038 / s41467-019-11202-z. ISSN 2041-1723.
  20. ^ Туо, Сильви; Мамелонет, Клэр; Саламе, Джоэль; Остаколо, Кевин; Чанез, Брайс; Салаун, Даниэль; Бодле, Эмили; Одебер, Стефан; Камоин, Люк; Бадаче, Али (22.04.2020). «Протеомный подход с меткой близости для исследования молекулярного ландшафта инвадоподий в клетках рака груди». Научные отчеты. 10 (1): 1–14. Дои:10.1038 / с41598-020-63926-4. ISSN 2045-2322.
  21. ^ Минде, Дэвид-Поль; Рамакришна, Манаса; Лилли, Кэтрин С. (22 января 2020 г.). «Близкое связывание с биотином способствует развитию развернутых белков и позволяет изучать внутренне неупорядоченные области». Биология коммуникации. 3 (1): 1–13. Дои:10.1038 / с42003-020-0758-у. ISSN 2399-3642.
  22. ^ Тамура, Томонори; Такато, Микико; Шионо, Кейя; Хамачи, Итару (05.12.2019). «Разработка фотоактивируемого метода метки близости для идентификации ядерных белков». Письма по химии. 49 (2): 145–148. Дои:10.1246 / кл.190804. ISSN 0366-7022.