WikiDer > Бактериальный дисплей

Bacterial display

Бактериальный дисплей (или же дисплей бактерий или же бактериальный дисплей поверхности) - это метод белковой инженерии, используемый для in vitro эволюция белка. Библиотеки полипептиды отображается на поверхности бактерии можно проверить с помощью проточной цитометрии или итеративные процедуры отбора (биопэннинг). Этот метод белковой инженерии позволяет нам связать функцию белка с геном, который его кодирует. Бактериальный дисплей может использоваться для поиска целевых белков с желаемыми свойствами и может использоваться для определения аффинности лиганды которые специфичны для клетки. Эта система может использоваться во многих приложениях, включая создание новых вакцин, идентификацию ферментные субстраты и обнаружение сродства лиганда к его белку-мишени.

Бактериальный дисплей часто сочетается с магнитно-активированная сортировка клеток (MACS) или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS) техники. Конкурирующие методы эволюции белка in vitro находятся фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей, и отображение мРНК. Дисплей бактериофага - наиболее распространенный тип используемой системы отображения. [1] хотя бактериальный дисплей становится все более популярным по мере преодоления технических проблем. Бактериальный дисплей в сочетании с FACS также имеет то преимущество, что это метод в реальном времени.

История

Системы отображения клеток были впервые использованы в 1985 году, когда пептиды были генетически слиты с белками, отображаемыми на Бактериофаг M13. Отображение бактериофагов - это широко используемая система отображения клеток, хотя она имеет ограничения по размеру отображаемых белков. Затем в 1986 году был введен бактериальный дисплей, позволяющий отображать на поверхности более крупные белки. Системы бактериального дисплея были впервые представлены Freudl et al. и Charbit et al. в 1986 году, когда они использовали бактериальные поверхностные белки OmpA и LamB для отображения пептидов. Freudl et al. слитые пептиды с линкерами с ompA ген, вызывающий экспрессию пептидов в белках OmpA. Они показали, что белки теперь могут расщепляться протеиназа К. Таким образом, вставленные пептиды, не являющиеся OmpA, были мишенью для протеиназы К. Вставка чужеродных пептидов не влияла на рост бактериальных клеток. Charbit et al. во-первых, определили области белка LamB, которые были «разрешающими» для вставки чужеродного петида (т.е. что не привело к полной потере функциональности белка). Затем они исследовали универсальность пермиссивных сайтов (предел размера, природа эпитопа, ...), которые все были расположены в открытых петлях тримерной внешней мембраны порина, с целью разработки поливалентных живых бактериальных вакцин (12-15 ). Это было первое доказательство использования методов бактериального отображения поверхности для экспрессии белков на поверхности клеток без изменения функции клетки.[2]

Принцип

Пептиды очень полезны в качестве лечебных и диагностических веществ. Их использование становится все более популярным, а системы отображения предлагают полезный способ конструировать пептиды и оптимизировать их связывающие способности. Клетки экспрессируют поверхностные белки, которые могут участвовать во множестве ответов, включая распознавание других клеток, взаимодействие с другими клетками и клеточная сигнализация. Многие типы бактерий имеют белки клеточной поверхности, такие как энтеропатогенные Кишечная палочка интимин белок, который участвует в связывании с клетками-хозяевами, или белок OmpA Кишечная палочка ячеек, что важно для сохранения структуры внешняя мембрана.[3] Многие поверхностные белки участвуют в прикреплении бактериальных клеток и вторжении в хозяйскую клетку. Используя бактериальный дисплей, можно идентифицировать целевые белки на клетке-хозяине. Эти поверхностные белки необходимо сначала перемещенный через мембраны бактериальных клеток от цитоплазма к поверхности клетки. Грамотрицательные бактерии иметь дополнительный периплазматическое пространство, который Грамположительные бактерии не хватает, поэтому перед ними стоит более сложная задача по перемещению белков. Отображение гетерологичный Для белков на поверхности бактериальных клеток обычно требуется слияние белка с поверхностным белком, называемым каркасом.

Автотранспортная система
Система автотранспорта (система секреции типа V)

Строительные леса

Каркасы используются для отображения гетерологичного белка на поверхности бактериальной клетки. Были использованы различные каркасы, такие как белки внешней мембраны, белки фимбрий / жгутиков и CPX (OmpX с циркулярной перестановкой).[4] Каркас CPX позволяет слияние пептидов на обоих концах каркаса.

OMP - это обычные каркасы для бактериального дисплея. Белки также могут отображаться на поверхности бактериальных клеток за счет использования автотранспортеров. Автотранспортеры являются частью системы секреции типа V. Обычно они имеют три домена: лидерную последовательность на N-конце; центральная пассажирская зона; автотранспортерный домен на С-конце. Гетерологичный белок вставлен в домен-пассажир.[5] Другой метод слияния гетерологичных белков - слияние с фимбрии/жгутики, которые представляют собой нитчатые выступы на поверхности клетки. Существует много фимбрий в основном на грамотрицательных бактериях, поэтому отображение белков на фимбриях является преимуществом по сравнению с некоторыми другими поверхностными белками, которых меньше. Недостатком использования фимбрий является то, что существует относительно небольшой предел размера вставки 10-30 аминокислоты.[6]

Инструмент для проточного цитометра
Инструмент для проточного цитометра

После слияния гетерологичного белка с поверхностным белком бактериальной клетки он подвергается воздействию либо фермент, клетка (экспрессирующая целевой белок) или антитело (обычно флуоресцентно помеченный), в зависимости от приложения эксперимента. Затем образец пропускается через луч света во время FACS в очень узком потоке жидкости, так что только одна клетка может проходить одновременно, и испускаемая флуоресценция регистрируется. Информация о размере клетки может быть получена путем рассеяния света, и если произошло связывание гетерологичного белка с целевым белком / клеткой, испускается больше флуоресценции.

Приложения

Отображение бактериальной поверхности можно использовать для множества приложений. К ним относятся скрининг на основе аффинности, антитела картирование эпитопа, идентификация пептидных субстратов, идентификация клеточно-связывающих пептидов и создание вакцины.[7]

Скрининг на основе аффинности

Скрининг используется для выявления очевидного сродства гетерологичных белков, отображаемых на поверхности бактериальных клеток, к целевым белкам. Этот метод обычно сочетается с FACS, и добавление нефлуоресцентного конкурента целевого белка полезно для получения более точных аффинностей связывания. Добавление конкурента снижает вероятность повторного связывания белков-мишеней, что делает аффинность связывания менее точной.

Картирование эпитопа антител

Картирование эпитопа антител используется для определения специфичности антитела. В эпитоп (сайт связывания антител антигенов) экспрессируется на поверхности бактериальной клетки путем экспрессии участка гена, кодирующего антиген. Проточная цитометрия с флуоресцентно мечеными антителами используется для определения количества антител, связывающихся с эпитопом.[8]

Идентификация пептидных субстратов

Это может быть использовано для поиска лучших субстратов для протеолитические ферменты. Субстрат отображается на поверхности бактериальной клетки между аффинным лигандом и каркасом, и кинетика протеолиза субстрата измеряется с помощью FACS.

Идентификация клеточно-связывающих пептидов

Бактериальный дисплей можно использовать для поиска пептидов, которые связываются с конкретными клетками, например. клетки рака груди или стволовые клетки. Отображаемые белки флуоресцентно помечены GFP, поэтому связывающие взаимодействия между пептидами и клетками-мишенями можно увидеть с помощью проточной цитометрии. Контрольные образцы необходимы для измерения уровней флуоресценции в отсутствие отображаемых пептидов. Также требуются образцы, которые не содержат отображаемых пептидов, но содержат клетки млекопитающих и бактериальные клетки (включая каркас).

Доставка вакцины

Вакцина Доставка - очень распространенное применение отображения бактериальной поверхности. Есть два типа живых бактериальных вакцин, которые могут быть изготовлены:

  1. Обычно патогенные бактерии ослаблены, поэтому они больше не являются патогенными.
  2. Комменсал или пищевые бактерии, не являющиеся патогенными.

Использование бактериального поверхностного отображения антигенов является ценной альтернативой традиционному дизайну вакцины по разным причинам, одна из которых заключается в том, что белки, экспрессируемые на поверхности бактериальных клеток, могут действовать как адъювант. Обычные вакцины требуют добавления адъювантов. Еще одно преимущество создания вакцин с использованием бактериальных дисплейных систем заключается в том, что целая бактериальная клетка может быть включена в живую вакцину. [9] В отличие от систем бактериофагового дисплея, которые обычно используются при разработке вакцин для поиска неизвестных эпитопов, бактериальные дисплейные системы используются для экспрессии известных эпитопов, а клетки действуют как система доставки вакцины.[10]

Сравнение с фаговым дисплеем

В аналогичных условиях выбор бактериально-отображаемых пептиды моделировать белок стрептавидин оказалось хуже.[11]

Рекомендации

  1. ^ Кенрик С.А., Догерти П.С. (2010). «Бактериальный дисплей обеспечивает эффективное и количественное созревание пептидного сродства». Белок Eng Des Sel. 23 (1): 9–17. Дои:10.1093 / белок / gzp065. ЧВК 2791049. PMID 19903738.
  2. ^ Фрейдл Р., Макинтайр С., Деген М., Хеннинг У. (1986). "Воздействие на клеточную поверхность белка OmpA внешней мембраны Escherichia coli K-12". Дж Мол Биол. 188 (3): 491–4. Дои:10.1016/0022-2836(86)90171-3. PMID 3525847.
  3. ^ Ван И (2002). «Функция OmpA в Escherichia coli». Biochem Biophys Res Commun. 292 (2): 396–401. Дои:10.1006 / bbrc.2002.6657. PMID 11906175.
  4. ^ Getz JA, Schoep TD, Daugherty PS (2012). «Открытие пептидов с использованием бактериального дисплея и проточной цитометрии». Белковая инженерия для терапии, Часть B. Методы Энзимол. Методы в энзимологии. 503. С. 75–97. Дои:10.1016 / B978-0-12-396962-0.00004-5. ISBN 9780123969620. PMID 22230566.
  5. ^ Вернерус Х, Шталь С (2004). «Биотехнологические применения бактерий поверхностной инженерии». Biotechnol Appl Biochem. 40 (Pt 3): 209–28. Дои:10.1042 / BA20040014. PMID 15035661. S2CID 9395029.
  6. ^ Клемм П., Шембри М.А. (2000). «Бактериальные адгезины: функция и структура». Int J Med Microbiol. 290 (1): 27–35. Дои:10.1016 / S1438-4221 (00) 80102-2. PMID 11043979.
  7. ^ Догерти PS (2007). «Белковая инженерия с бактериальным дисплеем». Curr Opin Struct Biol. 17 (4): 474–80. Дои:10.1016 / j.sbi.2007.07.004. PMID 17728126.
  8. ^ Рокберг Дж., Лофблом Дж., Хьельм Б., Улен М., Шталь С. (2008). «Картирование эпитопа антител с использованием дисплея бактериальной поверхности». Методы природы. 5 (12): 1039–45. Дои:10.1038 / nmeth.1272. PMID 19029907. S2CID 12078882.
  9. ^ Вестерлунд-Викстром Б (2000). «Пептидный дисплей на бактериальных жгутиках: принципы и применение». Int J Med Microbiol. 290 (3): 223–30. Дои:10.1016 / S1438-4221 (00) 80119-8. PMID 10959724.
  10. ^ Бенхар I (2001). «Биотехнологические применения фагов и клеточного дисплея». Достижения биотехнологии. 19 (1): 1–33. Дои:10.1016 / S0734-9750 (00) 00054-9. PMID 14538090.
  11. ^ Лундер и др. (2005). «Сравнение бактериальных и фаговых пептидных библиотек в поисках связанного с мишенью мотива». Прикладная биохимия и биотехнология. 127 (2): 125–131. Дои:10.1385 / ABAB: 127: 2: 125. PMID 16258189. S2CID 45243314.

12. Charbit A, Boulain JC, Ryter A, Hofnung M. Исследование топологии бактериального мембранного белка путем генетической вставки чужеродного эпитопа; экспрессия на поверхности клетки. EMBO J. 1986, ноябрь; 5 (11): 3029-37.

13. Charbit A, Sobczak E, Michel ML, Molla A, Tiollais P, Hofnung M. Представление двух эпитопов области preS2 вируса гепатита B на живых рекомбинантных бактериях. J Immunol. 1 сентября 1987 г .; 139 (5): 1658-64.

14. Чарбит А., Молла А., Саурин В., Хофнунг М. Универсальность вектора для экспрессии чужеродных полипептидов на поверхности грамотрицательных бактерий. Ген. 15 октября 1988 г .; 70 (1): 181-9.

15. Ньютон С.М., Клебба П.Е., Мишель В., Хофнунг М., Чарбит А. Топология мембранного белка LamB путем мечения эпитопа и сравнения с рентгеновской моделью. J Bacteriol. 1996 июн; 178 (12): 3447-56.