WikiDer > Strep-tag - Википедия

Strep-tag - Wikipedia

Система Strep-tag® - это метод, который позволяет очищать и обнаруживать белки к аффинная хроматография. В Стреп-тег II - синтетический пептид состоящий из восьми аминокислоты (Trp-Сер-Его-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys). Эта пептидная последовательность проявляет внутреннее сродство к Strep-Tactin®, специально разработанному стрептавидин, и могут быть слиты на N- или C-конце с рекомбинантными белками. Используя весьма специфическое взаимодействие, Strep-меченные белки можно выделить за один этап из неочищенных клеточных лизатов. Поскольку Strep-tag элюируется в щадящих физиологических условиях и особенно подходит для генерации функциональных белков.[1][2]

Развитие и биохимия Strep-tag

Стрептавидин представляет собой тетрамерный белок, экспрессируемый в Streptomyces avidinii. Из-за его высокого сродства к витамину h-биотин, Стрептавидин обычно используется в области молекулярная биология и биотехнология. Strep-tag был первоначально выбран из генетической библиотеки для специфического связывания с протеолитически усеченной «базовой» версией стрептавидина. За прошедшие годы Strep-tag был систематически оптимизирован, чтобы обеспечить большую гибкость при выборе места прикрепления. Кроме того, его партнер по взаимодействию, стрептавидин, также был оптимизирован для увеличения способности связывания пептидов, что привело к развитию Strep-Tactin. Аффинность связывания Strep-tag со Strep-Tactin почти в 100 раз выше, чем со стрептавидином. Так называемая система Strep-tag, состоящая из Strep-tag и Strep-Tactin, оказалась особенно полезной для функционального выделения и анализа белковых комплексов в протеом исследование.[3]

Принцип Strep-tag

Как и другие теги с короткой привязкой (Его тег, ФЛАГ-тег), Strep-tag легко сливается с рекомбинантный белков во время субклонирования своих кДНК или же ген. Для его экспрессии различные векторы для различных организмов-хозяев (Кишечная палочка, дрожжи, насекомое, и млекопитающее ячейки) доступны.[4] Особым преимуществом Strep-tag является его довольно маленький размер и то, что с биохимической точки зрения он практически инертный. Следовательно, на сворачивание или секрецию белка не влияет и обычно это не влияет на функцию белка. Strep-tag особенно подходит для анализа функциональных белков, поскольку процедуру очистки можно проводить в физиологических условиях. Это не только позволяет изолировать чувствительные белки в нативном состоянии, но также можно очищать интактные белковые комплексы,[5] даже если только одна субъединица несет тег.

На первом этапе цикла очистки Strep-tag клеточный лизат содержащий слитый белок Strep-tag, наносят на колонку с иммобилизованным Strep-Tactin (шаг 1). После того, как меченый белок специфически связался со Strep-Tactin, короткий этап промывки с физиологическим буфер (например, PBS) удаляет все другие белки-хозяева (шаг 2). Это связано с его чрезвычайно низкой склонностью к неспецифическому связыванию белков. Затем очищенный слитый белок Strep-tag осторожно элюируют с низкой концентрацией дестиобиотин, который специфически конкурирует за карман связывания биотина (шаг 3). Чтобы регенерировать колонку, дестиобиотин удаляют путем нанесения раствора, содержащего HABA (желтый азокраситель). Об удалении дестиобиотина свидетельствует изменение цвета с желто-оранжевого на красный (этап 4 + 5). Наконец, раствор HABA смывается небольшим объемом рабочего буфера, что делает колонку готовой к использованию для следующей очистки. запустить.

Приложения Strep-tag

Система Strep-tag предлагает высокоселективный инструмент для очистки белков в физиологических условиях. Полученные белки биоактивны и обладают очень высокой чистотой (более 95%). Кроме того, система Strep-tag может использоваться для обнаружения белка в различных анализах. В зависимости от условий эксперимента, антитела к Strep-tag или же Strep-Tactin с ферментативным (например,пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза (AP)) или флуоресценции (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP)) маркер. Если требуется высокая чистота, лизат можно очистить, используя сначала Strep-Tactin, а затем выполнить второй цикл с использованием антител против Strep-tag. Это снижает загрязнение неспецифическими связанными белками, которое может происходить в некоторых редких случаях.

С помощью системы обнаружения Strep-tag можно провести следующие анализы:

Поскольку Strep-tag способен выделять белковые комплексы, также могут быть применены стратегии изучения белок-белковых взаимодействий. Другой вариант - иммобилизация белков Strep-tag специфическим высокоаффинным антителом на микропланшетах или биочипах.

Система Strep-Tag / StrepTactin также используется в оптических пинцетах для одиночных молекул и в экспериментах с АСМ, демонстрируя высокую механическую стабильность, сопоставимую с самыми прочными нековалентными связями, доступными в настоящее время.[6]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Шмидт, Томас GM; Скерра, Арне (2007). «Система Strep-tag для одноэтапной очистки и высокоаффинного обнаружения или захвата белков». Протоколы природы. 2 (6): 1528–35. Дои:10.1038 / nprot.2007.209. PMID 17571060.
  2. ^ Скерра, А; Шмидт, Т.Г. (2000). «Использование Strep-Tag и стрептавидина для обнаружения и очистки рекомбинантных белков». Методы в энзимологии. Методы в энзимологии. 326: 271–304. Дои:10.1016 / S0076-6879 (00) 26060-6. ISBN 978-0-12-182227-9. PMID 11036648.
  3. ^ Остермайер, Кристиан; Харренга, Аксель; Эрмлер, Ульрих; Мишель, Хартмут (1997). "Структура при разрешении 2,7 Å Paracoccus denitrificans двухсубъединичная цитохром с оксидаза в комплексе с антителом FV фрагмент". Труды Национальной академии наук. 94 (20): 10547–53. Дои:10.1073 / пнас.94.20.10547. ЧВК 23397. PMID 9380672.
  4. ^ [1]
  5. ^ Junttila, Melissa R .; Сааринен, Сусанна; Шмидт, Томас; Каст, Юрген; Вестермарк, Юкка (2005). «Одностадийная очистка Strep-tag для выделения и идентификации белковых комплексов из клеток млекопитающих». Протеомика. 5 (5): 1199–203. Дои:10.1002 / pmic.200400991. PMID 15761952.
  6. ^ Moayed F, Mashaghi A, Tans SJ (2013) Гибрид полипептида-ДНК с возможностью селективного связывания, применяемый для наномеханических измерений одиночных молекул с помощью оптического пинцета. PLoS ONE 8 (1): e54440. DOI: 10.1371 / journal.pone.0054440 [2]

внешняя ссылка