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Immunhistochemische Markierung von Tyrosinhydroxylase (grün) im Axone von sympathisch autonom Nervenzellen

Immunhistochemie, Immunhistochemie^[1] oder IHC bezieht sich auf die Technik der Lokalisierung von Komponenten (Antigene) im biologisches Gewebe mit bestimmten Antikörper.^[2] Der Name setzt sich zusammen aus "immunis", was sich auf die verwendeten Antikörper bezieht, "histos", das Gewebe meint.

Immunhistochemie wird häufig verwendet, um Diagnose von abnormalen Zellen, wie sie in Tumore. Wir suchen nach molekularen Markern, die für bestimmte zelluläre Prozesse charakteristisch sind, wie z Proliferation oder programmierter Zelltod (Apoptose). IHC wird verwendet, um die Verteilung und Lokalisierung von Biomarker und ungleichmäßig auftreten Protein in verschiedenen Teilen des biologischen Gewebes.

Die Visualisierung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erfolgt auf verschiedene Weise. Normalerweise ist der Antikörper an a . gebunden Enzym, wie Peroxidase, das eine farbbildende Reaktion katalysieren kann (siehe Immunperoxidase-Färbung). Außerdem kann der Antikörper mit a . markiert werden Fluorophor, wie Fluoreszein, Rhodamin oder Alexa Fluoro (sehen Immunfluoreszenz), mit einer Metallbeschichtung, wie z Immungold zwecks Elektronenmikroskopie oder mit a Radioisotop zwecks Autoradiographie.

Arten von Antikörpern

Die für den spezifischen Nachweis verwendeten Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Monoklonale Antikörper hätten die höchste Spezifität. Polyklonale Antikörper werden hergestellt, indem einem Tier ein Peptidantigen injiziert wird, wonach a sekundäre Immunantwort wird stimuliert, sodass Antikörper aus dem Serum. Polyklonale Antikörper sind somit eine heterogene Mischung von Antikörpern mit unterschiedlichen Epitope erkennen kann.

Antikörper können auch als primäre oder sekundäre Reagenzien klassifiziert werden. Primärantikörper werden gegen ein bestimmtes Antigen gebildet und sind unkonjugiert oder unmarkiert, während Sekundärantikörper gegen Primärantikörper gebildet werden. Auf diese Weise erkennen Sekundärantikörper die Antikörper einer bestimmten Tierart und werden mit Biotin oder ein anderes Enzym wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase (HRP). Einige sekundäre Antikörper sind konjugiert zu einer fluoreszierend Stoffe wie die Alexa Fluor- oder DyLight Fluor-Familie. Diese werden häufig zum Nachweis von Proteinen in IHC verwendet. Die Proteinkonzentration wird normalerweise durch Densitometrie gemessen, wobei die Intensität der Färbung mit der Menge des markierten Proteins korreliert.

Probenvorbereitung

Im Verfahren werden je nach Verwendungszweck und Dicke der Probe entweder dünne (ca. 4-40 ich) Zuschnitte aus dem Stoff oder, wenn der Stoff nicht sehr dick ist, ganz verwendet. Das Schneiden erfolgt in der Regel durch a Mikrotom, wonach die Schnitte auf Objektträgern platziert werden. Free-floating IHC verwendet Schnitte, die nicht auf einem Objektträger platziert und mit einem vibrierenden Mikrotom hergestellt werden.

Direkte und indirekte IHC

Für den immunhistochemischen Nachweis von Antigenen im Gewebe gibt es zwei Techniken, die Direkte Methode und die indirekt Methode. In beiden Fällen erfordern viele Antigene einen zusätzlichen Schritt zur Demaskierung, der oft den Unterschied macht, ob sie gefärbt werden oder nicht. Im Kontrast zu Immunzytochemie das Gewebe muss nicht permeabilisiert werden, da dies bereits bei der Präparation durch das Mikrotom erfolgt ist. Um die zu reduzieren Oberflächenspannung wird eingesetzt Reinigungsmittel, wie Triton X-100, dies reduziert den Bedarf an Reagenzien und sorgt für eine bessere Abdeckung der Probe.

Sofort

Das direkte Methode ist eine einstufige Technik, die eine beschriftete Antikörper (beispielsweise FITC konjugiert Antiserum), die direkt mit dem . reagiert Antigen im Gewebe. Diese Technik verwendet nur eine Antikörperinkubation und ist daher einfach und schnell. Ein Nachteil dieser Technik besteht darin, dass es aufgrund einer zu geringen Verstärkung des Signals zu Problemen mit der Empfindlichkeit kommen kann und wird daher weniger verwendet als die indirekte Methode.

Indirekt

Das indirekte Methode verwendet einen unmarkierten Primärantikörper (erste Schicht), der mit dem Gewebe reagiertAntigen und von einem markierten sekundärer Antikörper (zweite Schicht), die mit dem primären Antikörper reagiert. Der Sekundärantikörper muss gegen den Antikörper der Tierart gebildet werden, die den Primärantikörper produziert hat. Dieses Verfahren ist aufgrund der Signalverstärkung empfindlicher als das direkte Verfahren, da der Primärantikörper mehrere Bindungsstellen für den Sekundärantikörper aufweist. Die zweite Schicht kann mit einer fluoreszierenden Substanz oder einem Enzym markiert werden.In einem gängigen Verfahren wird ein biotinylierter Sekundärantikörper mit StreptavidinMeerrettich-Peroxidase. Dies antwortet mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), das an Stellen, an denen die primären und sekundären Antikörper binden, eine braune Färbung ergibt. Diese Methode wird als DAB-Färbung bezeichnet. Unter Verwendung von Nickel die Reaktion kann verstärkt werden, da eine tiefviolette/graue Farbe gebildet wird.

Der Vorteil der indirekten Methode besteht neben der höheren Sensitivität darin, dass nur relativ wenige konjugierte (markierte) Sekundärantikörper hergestellt werden müssen. Zum Beispiel ist ein markierter sekundärer Antikörper, der gegen Kaninchen-Antikörper produziert wird, der als solcher gekauft werden kann, mit jedem in einem Kaninchen produzierten primären Antikörper nützlich. Bei der direkten Methode ist es notwendig, für jedes Antigen spezifisch markierte Antikörper zu verwenden.

Diagnostische IHC-Marker

Immunhistochemie eines normalen Niere mit CD10.

IHC hat den großen Vorteil, dass genau angegeben werden kann, wo sich ein bestimmter Bestandteil innerhalb des untersuchten Gewebes befindet. Darüber hinaus ist IHC eine wirksame Methode zur Untersuchung von Geweben. In dem Neurologie Es wird verwendet, um bestimmte Proteine ​​in bestimmten Teilen des Gehirns zu verhindern. Ein großer Nachteil ist, dass im Gegensatz zu Immunblotting wobei die Färbung mit Hilfe des Molekulargewicht, dass es unmöglich ist zu beweisen, dass die Färbung dem gesuchten Protein entspricht. Daher müssen Primärantikörper durch ein Verfahren wie z westlicher Fleck. Die Technik wird noch mehr in der Diagnostik eingesetzt chirurgische Pathologie zur Typisierung von Tumoren (z. B. Immunfärbung von E-Cadherin zur Unterscheidung der positiv gefärbten Karzinom in situ (DCIS) und das negativ gefärbte lobuläre Carcinoma in situ (LCIS)^[3]).

• Karzinoembryonales Antigen (CEA): verwendet, um zu identifizieren Adenokarzinome. Nicht speziell.
• Zytokeratine: wird zur Identifizierung von Karzinomen verwendet, kommt aber auch bei Sarkomen vor.^[4]
• CD15 und CD30 : verwendet für Morbus Hodgkin
• Alpha Fetoprotein: vor dem Dottersacktumore und Leberzellkarzinom
• CD117 (KIT): für gastrointestinale Stromatumoren (HEFE)
• CD10 (CALLA): für Nierenzellkarzinom und akute lymphatische Leukämie
• Prostata-spezifisches Antigen (PSA): für Prostatakrebs
• Östrogen und Progesteron Färbung zur Tumoridentifikation
• Identifizierung von B-ZelleLymphom mit CD20
• Identifizierung von T-ZelleLymphom mit CD3

Leitende Therapie

Bei Krebs werden eine Reihe von molekularen Strömen verändert, und einige dieser Veränderungen können bei der Krebstherapie gezielt werden. Immunhistochemie kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Tumore für eine Therapie anfällig sein könnten, indem das Vorhandensein oder die erhöhte Menge des molekularen Ziels nachgewiesen wird.

Chemische Inhibitoren

Die Biologie eines Tumors bietet eine Reihe potenzieller intrazellulärer Angriffspunkte. Viele Tumore sind hormonabhängig. Das Vorhandensein von Hormonrezeptoren kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob der Tumor empfindlich auf eine antihormonelle Therapie reagiert. Eine der ersten Therapien war das Antiöstrogen, Tamoxifen, zur Behandlung von Brustkrebs. Diese Hormonrezeptoren können durch Immunhistochemie nachgewiesen werden.^[5]imatinib, ein intrazelluläres TyrosinkinaseInhibitor, wurde entwickelt, um chronische myeloische Leukämie, eine Krankheit, die durch die Bildung einer spezifischen abnormalen Tyrosinkinase gekennzeichnet ist. Es hat sich gezeigt, dass Imitanib gegen Tumore wirksam ist, die andere Tyrosinkinasen enthalten, insbesondere KIT. Die meisten gastrointestinalen Stromatumoren weisen eine KIT auf, die immunhistochemisch nachgewiesen werden kann.^[6]

Literatur Referenzen

Externe Links

• Yale Core Tissue Microarray Facility
• Histochemische Färbemethoden - Universität Rochester Abteilung für Pathologie
• Immunhistochemie-Färbungsprotokolle und Bildergalerie
• Immunhistochemie-Färbungsprotokoll
• HistoWiki-Eintrag für Immunhistochemie
• Burnett R, Guichard Y, Barale E (1997). Immunhistochemie für die Lichtmikroskopie bei der Sicherheitsbewertung von Therapeutika: ein Überblick. Toxikologie 119 (1): 83–93. PMID: 9129199. DOI: 10.1016/S0300-483X(96)03600-1.
• Joyner, A. (2008). Immunhistochemie von Whole-Mount-Mausembryonen. Cold Spring Harbor-Protokolle 2008: pdb.prot4820. DOI: 10.1101/pdb.prot4820.